Introducción. La enfermedad de Chagas, cuyo agente causal es Trypanosoma cruzi, constituye una antropozoonosis ampliamente distribuida en América Latina. Los estudios moleculares y los perfiles genéticos han demostrado que el parásito presenta una gran variabilidad y han permitido la clasificación de T. cruzi en seis unidades discretas de tipificación (I-VI), de las cuales, TcII a TcVI han sido ampliamente caracterizadas por distintos marcadores moleculares. Objetivo. Evaluar la variabilidad genética de TcI, mediante el uso de marcadores de microsatélites. Materiales y métodos. Se evaluaron siete microsatélites en quince aislamientos colombianos obtenidos mediante PCR a partir de reservorios, vectores y humanos, y se analizaron en un gel para desnaturalizar de poliacrilamida de un secuenciador láser fluorescente automático (ALF). Los datos se analizaron en un software para análisis de genética de poblaciones (Arlequin® 3.1 y Microsat®). Resultados. Los resultados demostraron variabilidad dentro de TcI al obtener 24 alelos, de los cuales, 12 se reportan por primera vez. Aunque se encontraron genotipos asociados a la infección humana y al ciclo selvático de transmisión, ningún locus permitió comprobar la presencia de los genotipos previamente reportados. Los parámetros de heterocigocidad observada y esperada, permitieron determinar la presencia de dos poblaciones (aislamientos domésticos y selváticos); asimismo, el desequilibrio de ligamento facilitó la creación de dos mapas físicos para los loci analizados. Conclusiones. Se corrobora la gran variabilidad genética presente en TcI, lo que sugiere un patrón de variación intraespecífica en Colombia.