O desoxinivalenol (DON), principal micotoxina encontrada em trigo e derivados, tem sido associado a surtos de gastroenterite, distúrbios gastrointestinais e diarreia em humanos e animais. Para controle das micotoxinas em alimentos há a necessidade de métodos confiáveis e precisos. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo validar metodologia analítica para análise de DON em amostras de trigo e produtos comercializados na cidade de São Paulo. O método foi validado de acordo com os parâmetros linearidade, recuperação, precisão, limites de detecção (LD) e quantificação (LQ). A extração do DON foi realizada por homogeneização com água deionizada, seguida de centrifugação, filtração e purificação em coluna de imunoafinidade. A separação e quantificação foram conduzidas por cromatografia líquida com detecção por ultravioleta (CLAE-UV). A curva analítica, obtida pelo método dos mínimos quadrados, foi linear com coeficiente de correlação de 0,9995. A recuperação média foi de 102% e o coeficiente de variação de 2,4% para a concentração de 877 μg/kg. Os LD e LQ foram de 60 e 200 μg/kg, respectivamente. Os cromatogramas obtidos não apresentaram interferências na região do tempo de retenção do DON (9,7 min), sendo o método proposto considerado adequado para a quantificação de desoxinivalenol em trigo e produtos a base de trigo