O diagnóstico laboratorial precoce de raiva humana deve ser realizado por testes apropriados, visto que a aplicação de protocolos de tratamento médico em indivíduos internados depende dos resultados laboratoriais. O presente estudo analisou os dados referentes aos 560 casos suspeitos de raiva humana submetidos ao diagnóstico virológico no IP-SP entre os anos de 1970 e 2020. Houve um avanço das metodologias laboratoriais, especialmente as moleculares, que passaram a ser essenciais, possibilitando o tratamento de indivíduos expostos, bem como a determinação da fonte de infecção dos casos, fato fundamental para a efetividade de ações de controle em regiões vulneráveis à disseminação da doença. Intervenções no ciclo urbano da raiva, por meio de vacinação de cães e gatos e encaminhamento de amostras para diagnóstico, diminuiram os casos transmitidos por cães, principalmente no Sudeste. Em contrapartida, no mesmo período foi observado um aumento exponencial de casos relacionados ao ciclo silvestre nas regiões Norte (32%) e Nordeste (53,3%), tendo os morcegos como principais transmissores (72%), seguidos dos primatas não humanos (6%) e dos canídeos silvestres (1%). Esses resultados demonstraram a importância do aprimoramento do diagnóstico laboratorial, que é parte essencial na condução de estratégias de controle, bem como de tratamento de indivíduos expostos.