Detecção de DNA de Mycobacterium leprae utilizando qPCR 16S rRNA

Margotti, Gustavo Costa; Paiva, Pedro Renato Bodo de

A hanseníase é doença crônica de evolução lenta, causada pelo Mycobacterium leprae (M. leprae), para a qual o diagnóstico é essencialmente clínico. Abordagens histológicas, baciloscópicas e sorológicas, como apoio diagnóstico, têm suas limitações e são menos eficazes para o diagnóstico da doença em estágios iniciais ou na detecção de infecções assintomáticas por M. leprae. Com o objetivo de superar esse gargalo, análises por PCR em tempo real (qPCR) buscando vários alvos gênicos do bacilo têm auxiliado no diagnóstico da hanseníase. O serviço do ILSL realiza de rotina qPCR para detecção de M. leprae utilizando a sequência repetitiva RLEP como alvo. Mesmo apresentando elevada sensibilidade e especificidade, a técnica em si pode falhar na detecção de casos com carga bacilar abaixo de seu limiar de detecção. O objetivo do trabalho foi detectar a presença de 16S rRNA de M. leprae utilizando qPCR em amostras do banco de amostras já testadas para RLEP no ILSL e comparar os resultados das duas abordagens como ferramenta de apoio diagnóstico para pacientes com hanseníase.

Setenta e uma amostras de DNA do banco de amostras do ILSL foram subdivididas de acordo com seu resultado prévio para o gene RLEP:

grupo I (CT < 25, 23/71), grupo II (25 > CT < 40, 23/71) e grupo III (CT > 40, 25/71), e então, estudadas quanto à presença do rRNA 16S através de qPCR utilizando-se o sistema TaqMan®. Quando comparamos o CT de RLEP e 16S rRNA, observamos que as amostras dos grupos I e II que apresentaram CT de 16S rRNA acima do de LEP, diferiram na média de 2,6 e 2,4 pontos, respectivamente. No grupo II, 6/23 (26%) amostras apresentaram o mesmo CT para RLEP e 16S rRNA. Dezoito (18/25 - 72%) amostras do grupo III apresentaram CT 16S rRNA < 40, variando entre 36 a 40 e diferindo 2,7 pontos abaixo do CT RLEP. Essas divergências podem ser explicadas pela escolha do alvo e química utilizada na qPCR, SYBR Green para RLEP e TaqMan® para 16S rRNA. A RLEP, que apresenta múltiplas cópias no genoma, mostrou-se mais sensível na detecção de M. leprae quando comparado a 16S rRNA, alvo de cópia única. No caso do grupo III, considerando que TaqMan® é mais específico e menos sensível que SYBR Green sugerimos que os resultados discrepantes entre a detecção de RLEP e rRNA 16S possam ser explicados pelo fato de termos adotado um limiar de corte superior (CT > 40) aos apresentados na literatura para esse alvo. Concluímos que DNA de M. leprae pôde ser detectado usando a técnica de qPCR 16S rRNA nas amostras do banco de amostras do ILSL. Esta poderia ser considerada uma ferramenta complementar à qPCR RLEP para o diagnóstico de hanseníase. No entanto, a detecção de 16S rRNA parece ser menos sensível que a técnica de qPCR RLEP adotada no laboratório.

Leprosy is an insidious chronic disease caused by Mycobacterium leprae (M. leprae). The diagnosis of leprosy is essentially clinical, and histology, bacilloscopy and serological approaches, used as diagnostic support, have limitations and are less effective for diagnosing disease in early stages or detecting asymptomatic M. leprae infections. In order to overcome this bottleneck, real-time PCR (qPCR) assays standardized for several gene targets of the bacillus have helped in the diagnosis of leprosy. The ILSL service routinely performs qPCR for RLEP detection. Even with high sensitivity and specificity, the technique itself may fail to detect cases with bacillary load below detection threshold. The objective of this work is to detect the presence of 16S rRNA from M. leprae using qPCR in samples from the ILSL’s sample bank already tested for RLEP and to compare the results of the two approaches as a complementary diagnostic tool for leprosy. Seventy-one DNA samples were subdivided according to their previous result for the RLEP gene: group I (CT < 25, 23/71), group II (25 > CT < 40, 23/71) and group III (CT > 40, 25/71). When comparing the CT of RLEP and 16S rRNA, we observed that the samples from groups I and II that presented CT of 16S rRNA above that of RLEP, differing by 2.6 and 2.4 points, respectively. In group II, 6/23 (26%) samples showed the same CT for RLEP and 16S rRNA. Eighteen (18/25 - 72%) samples from group III had CT 16S rRNA < 40, ranging from 36 to 40 and differing 2.7 points below the CT RLEP. These divergences can be explained by the choice of target and chemistry used in qPCR, SYBR® Green for RLEP and TaqMan® for 16S rRNA. The RLEP, that presents multiple copies in the genome, was more sensitive in the detection of M. leprae when compared to 16S rRNA, a single copy gene target. In group III, considering that TaqMan® is more specific and less sensitive than SYBR® Green, we suggest that the results can be explained by the adoption of a higher cut-off threshold (CT > 40) than those presented in the literature for this target. We concluded that M. leprae DNA could be detected using the qPCR 16S rRNA technique in samples from the ILSL sample bank. However, it appears to be less sensitive than the qPCR RLEP technique adopted in the laboratory.