A saúde única engloba a saúde animal, humana e ambiental, tornando-se cada vez mais relevante diante do crescente contato entre humanos e animais e das alterações ambientais. Nesse contexto, o estudo das zoonoses é de suma importância e emerge como um desafio global, com ferramentas moleculares e análise espacial contribuindo para a compreensão da epidemiologia das doenças de importância em saúde pública. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrência de micobactérias, agentes causadores de diversas doenças, em animais silvestres mortos por atropelamento em duas regiões brasileiras: Sul e Sudeste. Foram analisadas 43 amostras de pulmão, pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) convencional, utilizando primers da região da sequência repetitiva IS6110 do gênero Mycobacterium. Foi possível a amplificação de sete amostras, sendo três de Botucatu-SP e quatro de Santa Catarina (Águas de Chapecó, Gaspar e Doutor Pedrinho) . As amostras positivas foram sequenciadas, confirmando ser do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC), em Cerdocyon thous; Leopardus tigrinus; Didelphis albiventris; Cavia sp.; Akodon montensis; roedor sem identificação e Oligoryzomys sp., demonstrando que a Mycobacterium pode circular em diversas espécies, aumentando o risco de transmissão. Portanto, a identificação de micobactérias em diferentes espécies e regiões ressalta a importância de estudos epidemiológicos para melhor compreensão da doença, além de reforçar a importância de implementar medidas de prevenção e controle da tuberculose zoonótica.