A esporotricose é uma doença zoonótica causada pelo fungo termodimórfico Sporothrix sp., que afeta principalmente humanos e gatos podendo acometer também outros animais de sangue quente. A transmissão ocorre por contato traumático com fontes contaminadas, como mordeduras ou arranhaduras de animais infectados e vegetação contaminada. O aumento progressivo dos casos levou à sua classificação como notificação compulsória no estado de São Paulo, especialmente devido a emergência do agente etiológico Sporothrix brasiliensis, que se mostrou mais patogênico que o Sporothrix schenckii. Isso enfatiza a importância do trabalho epidemiológico para rastrear e caracterizar as espécies do complexo Sporothrix schenckii. Nos centros de referência, como o Instituto Adolfo Lutz, utiliza-se a metodologia de sequenciamento e PCR de regiões alvo para identificar corretamente as espécies de Sporothrix sp. e monitorar o aumento epidemiológico das diferentes linhagens. No entanto, os métodos moleculares, como PCR e sequenciamento genético, enfrentam o desafio do alto custo, tornando o MALDI-TOF uma alternativa viável. Contudo, o uso de bancos comerciais é limitado pela similaridade dos perfis proteômicos das espécies e pela falta de atualização com novas linhagens. O objetivo deste estudo foi criar uma biblioteca interna para recaracterizar as espécies Sporothrix brasiliensis, Sporothrix globosa, Sporothrix mexicana e Sporothrix schenckii do acervo do Núcleo de Coleções de Micro-organismos pela metodologia de MALDI-TOF. O banco in-house foi criado e obteve sensibilidade de 96,15% na identificação correta dos micro-organismos, comparando com os resultados obtidos por meio de métodos moleculares de PCR multiplex e sequenciamento Sanger, com escore médio de 2,32 na comparação dos espectros das linhagens validadas pelo banco in house, possibilitando desta forma o uso do banco como ferramenta diagnóstica para a vigilância e novos estudos.