Introducción. Streptococcus agalactiae es el principal agente etiológico causante de infección invasiva del recién nacido con cuadros clínicos que pueden cursar con septicemia, neumonía o meningitis con prevalencias hasta del 50 % a nivel mundial, donde se viene presentando un incremento en su resistencia antibiótica. Objetivo. Estimar la prevalencia de colonización vaginorrectal por S. agalactiae y su perfil de sensibilidad, en mujeres embarazadas atendidas en un hospital de tercer nivel. Materiales y métodos. Se muestrearon 121 mujeres gestantes mediante hisopado vaginal y rectal. Los cultivos se desarrollaron siguiendo la metodología recomendada por los Centers for Disease Control and Prevention (CDC) y se agregó el agar chromID Strepto B. Las colonias sugestivas se identificaron bioquímicamente y se determinaron los perfiles de sensibilidad según el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Resultados. La prevalencia de colonización por S. agalactiae en las mujeres gestantes fue del 20,66 %. Se obtuvieron 40 aislamientos del total de muestras analizadas, de los cuales, el 12,5 % no presentó sensibilidad a la penicilina. La sensibilidad a la levofloxacina, la clindamicina y la eritromicina fue de 100 %, 92,5 % y 87,5 %, respectivamente; no se encontró sensibilidad a la tetraciclina. El fenotipo iMLSB se encontró en tres y, el M, en dos de los 40 aislamientos. Conclusiones. La prevalencia de colonización vaginorrectal por S. agalactiae en la población de estudio, fue de 20,66 %. Se obtuvieron aislamientos no sensibles a la penicilina, y con resistencia a los macrólidos y las lincosamidas mediante el método de Kirby-Bauer. Por ello, es importante la búsqueda activa en las mujeres gestantes colonizadas por estreptococos del grupo B y la vigilancia epidemiológica constante para detectar cambios en los perfiles de sensibilidad de los aislamientos.