La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa, causada por diversas especies del Complejo Mycobacterium tuberculosis, actualmente se estima que un tercio de la población mundial se encuentra afectada por lo que representa una amenaza para la salud pública, principalmente por el surgimiento de cepas Multidrogorresistentes (MDR-TB) que presentan resistencia a Rifampicina e Isoniacida simultáneamente, fármacos de primera línea para el tratamiento de esta enfermedad. En la actualidad se emplean métodos moleculares para la detección de este agente infeccioso, en nuestro medio existen muy pocos o ningún trabajo acerca de la aplicación de métodos moleculares para la detección precisa y efectiva de cepas MDR-TB, es decir que además de identificar su presencia pueda darse un perfil de resistencia por lo menos a fármacos de primera línea. En este trabajo se estandarizó la técnica PCR en Tiempo Real por Análisis de Curvas Melting para la detección mutaciones en genes específicos que otorgan resistencia a estos antituberculosos utilizando un kit comercial. Se utilizaron once cepas de Mycobaterium tuberculosis fenotípicamente identificadas por cultivo y cuatro controles primarios del método para la determinación de resistencia Isoniacida y Rifampicina mediante cambios de temperatura de disociación. Los resultados de esta estandarización reflejaron que el método utilizado puede ser optimizado en rendimiento de reactivos y tiene una concordancia mayor al 80 % en el caso de Rifampicina, y más de 90% en el caso de Isoniacida en comparación con los datos fenotípicos. El método estandarizado disminuye el tiempo de detección de tuberculosis y permite obtener perfiles de resistencia a los principales antituberculosos de primera línea.