Las técnicas moleculares para la detección de infección natural y fuente de alimentación en vectores secundarios de la enfermedad de Chagas cuando son aplicadas a ejemplares capturados en áreas endémicas, históricamente ocupadas por Triatoma infestans, proporcionan a las investigaciones epidemiológicas respuestas más exactas con relación a la transmisibilidad de la enfermedad. El presente estudio tiene como objetivo emplear biomarcadores moleculares para evaluar el impacto de la infestación intra y peridomicilar de Triatoma sordida en viviendas bajo vigilancia entomológica de departamentos de la Región Oriental del Paraguay en el período 2007 al 2015. Un total de 559 ejemplares de T. sordida capturados en 253, 91 y 52 viviendas de los departamentos Paraguarí, San Pedro y Cordillera, respectivamente fueron analizados. La infestación detectada fue del 24% al 48% así como una elevada colonización intradomiciliar del 5% al 36% en los tres departamentos. La detección molecular de infección natural osciló entre el 14% y 44%; y en 111 ejemplares se determinó la fuente de alimentación. El marcador molecular citocromo b permitió demostrar por vez primera un elevado porcentaje de triatominos con sangre humana como fuente de alimentación, principalmente en Cordillera con un 82% (28/34 T. sordida capturados). Estos hallazgos dejan en evidencia el avance del T. sordida en la ocupación del nicho ecológico de T. cruzi y la capacidad de esta especie secundaria como vector en la transmisión de T. cruzi en comunidades de la Región Oriental