La sepsis neonatal es una importante causa de morbimortalidad. Se realizó un proceso investiga-tivo con el objetivo de describir la etiología y el patrón de susceptibilidad antimicrobiana de las bacterias aisladas más frecuentemente de los hemocultivos de neonatos con sepsis en el servicio de neonatología del Hospital General Docente de Ambato. La metodología empleada en esta investigación se basó en un estudio descriptivo, transversal y enfoque cuali-cuantitativo, empleando la técnica documental y el reporte de resultados como instrumento. De los 39 pacien-tes estudiados 64,10% fueron del género masculino. El 23,07% presentaron bajo peso y 33,33% una edad gestacional <37 semanas. El microorganismo más frecuente fue Staphylococcus epidermidis (51,28%) seguido de Escherichia coli (17,94%) y Staphylococcus aureus (15,38%). En relación al perfil de susceptibilidad antimicrobiana S. epidermidis y S. aureus se mostraron sensibles a linezolid y vancomicina en más del 80,00%, y presentaron alta resistencia a oxacilina (80,00 y 83,33%, respectivamente), estas cepas expresaron fenotípicamente el gen mecA. Las enterobacterias aisladas mostraron resistencia a amoxacilina/ácido clavulánico (61,53%), ampi-cilina/sulbactam (69,23%), ciprofloxacina (61,53%), ceftazidima (30,76%) y cefotaxima (38,46%). Además, cinco cepas de E. coli y Klebsiella pneumoniae eran fenotípicamente productoras de beta lactamasas de espectro extendido. En conclusión, es necesario realizar estu-dios locales de vigilancia microbiológica en los hospitales, con el fin de identificar los patógenos multirresistentes involucrados en las infecciones neonatales, reconocer los brotes y monitorizar los cambios que ocurren a través del tiempo; los cuales influyen finalmente, en la elección de los tratamientos empíricos.