Los genes implicados en los rasgos del pelaje de los gatos son útiles para el análisis de la estructura genética que presentan sus poblaciones. El objetivo de este trabajo fue determinar si existe diferenciación genética entre las poblaciones de gato doméstico de los municipios de Restrepo y Darién, los cuales se encuentran separados por el “Lago Calima”. Para esto se estimaron las frecuencias alélicas de diversos marcadores del pelaje y se determinó si estas poblaciones presentaban diferencias significativas en su estructura génica o si se encontraban en equilibrio Hardy–Weinberg, además, se realizó una comparación con otras poblaciones inventariadas en el Valle del Cauca. Posteriormente, se llevó a cabo un análisis de componentes principales (ACP-Biplot), para conocer la correlación entre las frecuencias alélicas y los aportes de cada una de ellas a la variabilidad. También se realizó una prueba de Mantel para estimar si existía correlación entre los índices de fijación (FST) y las distancias geográficas. La prueba de Mantel mostró que el gen Orange es el único que muestra una correlación positiva entre los índices de diferenciación FST y las distancias geográficas. La comparación de las poblaciones de interés con las del Valle del Cauca, evidenció que los genes que aportaron más a la variabilidad fueron Dilution (19,08%), Long hair (16,09%), Agouti (16,06%) e Inhibitor (14,04%). Sin embargo, se encontró que las poblaciones de Restrepo y Darién tienen perfiles genéticos similiares y se comportan como una sola según los valores del equilibrio Hardy-Weinberg y los FST. Debido a que no hay diferencias significativas entre las poblaciones estudiadas, se concluye que, aunque el Lago Calima sea una barrera geográfica, no tiene un efecto significativo en la diferenciación genética entre las poblaciones de gatos de Restrepo y Darién.