O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento e a validação de metodologia empregando a célula de difusão vertical para avaliação da liberação e permeação cutânea in vitro de nicotina a partir de adesivos transdérmicos. A célula de difusão vertical é considerada um aparato experimental importante em pesquisa e desenvolvimento e pode simular condições in vitro próximas aquelas observadas em ensaios clínicos. Neste trabalho foram avaliados dois dispositivos transdérmicos comercializados no Brasil para liberação controlada de 14 mg de nicotina em um período de 24 horas. Realizaram-se ensaios de liberação, usando membranas de diálise de celulose regenerada, e estudos de permeação cutânea, usando pele de orelha de porcos. Os resultados indicaram que a liberação da nicotina em ambos os dispositivos transdérmicos avaliados seguiu a cinética de Higuchi, enquanto que a permeação cutânea seguiu cinética de ordem zero. As velocidades de liberação foram diferentes para os dispositivos comerciais avaliados, entretanto não foram encontradas diferenças significativas para as velocidades de permeação cutânea. Conforme os estudos de validação, a metodologia mostrou-se apropriada para a avaliação in vitro da liberação e permeação cutânea a partir de adesivos transdérmicos de nicotina. O método proposto foi aplicado em estudos comparativos in vitro entre adesivos transdérmicos comerciais contendo nicotina. Deste modo, o método também pôde ser considerado como ferramenta útil que poderia ser aplicada durante o desenvolvimento de novas formulações transdérmicas para liberação de nicotina.