El propósito de este trabajo fue optimizar un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para efectuar el diagnóstico diferencial de Trypanosoma evansi y Trypanosoma vivax, usando cebadores previamente descritos: 21-mer/22-mer e ILO1264/ILO1265. La especificidad se evaluó efectuando pruebas preliminares sobre muestras de ADN purificado de diversas especies de parásitos y sobre mezclas de éstas. La sensibilidad se valoró empleando diluciones de ADN de aislados de referencia de T. evansi y T. vivax y concentraciones variables de cebadores. El ensayo optimizado mostró una sensibilidad de 10 pg de ADN, con especificidad para el Subgénero Trypanozoon (cebadores 21-mer/22-mer) y especificidad absoluta para T. vivax (cebadores ILO1264/ILO1265). Ambos grupos de cebadores mostraron potencialidad para detectar infecciones mixtas T. evansi/T. vivax. Un análisis de hibridación sobre el patrón de cariotipo de diversos Kinetoplastida, usando la sonda Te-ADN, mostró su carácter repetitivo y la distribución de su secuencia en diferentes cromosomas de T. evansi TE0. La PCR fue evaluada como herramienta diagnóstico de la presencia de tripanosomas en muestras sanguíneas de animales con infecciones experimentales, demostrando alta sensibilidad al detectar positividad hasta 72 horas antes que lo hicieran los métodos parasitológicos. Este ensayo también fue evaluado sobre muestras sanguíneas de búfalos de agua con infecciones naturales, mostrando alta sensibilidad y especificidad al detectar 9/86 muestras como positivas a T. vivax, revelando una tasa de infección activa de 10,47 por ciento; valor tres veces superior a los resultados de la evaluación microscópica de frotis teñidos (3,49 por ciento) y casi dos veces superior (6,98 por ciento) a la técnica parasitológica de microcentrifugación capilar. En ninguna de las muestras de búfalos evaluadas se detectó T. evansi.