Este trabalho teve como objetivo determinar o teste hiposmótico (HO) adequado a espécie eqüina e verificar sua variaçäo intra-ensaio. Utilizaram-se duas soluçöes de açúcar e duas soluçöes de eletrólitos em água destilada em seis diferentes osmolaridades: frutose, sacarose, citrato de sódio e cloreto de sódio e 50, 100, 150, 200, 250 e 300mOsmol/kg H2O. A incubaçäo nas soluçöes com 150mOsmol/kg H2O ou menos, nos quatro diferentes solutos, determinou aumento substancial da resposta ao teste HO. Nas soluçöes com osmolaridades de 150, 100 e 50, o número de espermatozóides reativos ao teste variou entre 25,50 a 38,75 por cento, independente do soluto utilizado. Observou-se tendência de melhores respostas ao teste HO com o uso de açúcares, entretanto o uso de frutose ficou restrito pela alteraçäo de visualizaçäo de gota citoplasmática. A soluçäo indicada para se realizar o teste HO para o sêmen eqüino é a de sacarose a 100mOsmol/kg H2O, com variabilidade intra-ensaio média de 12,18 mais ou menos 7,41, indicando alta repetibilidade