Em consultórios odontológicos, são utilizadas canetas de alta rotação que funcionam conectadas a circuitos de água. Estudos já demonstraram contaminação microbiana em amostras de água coletada de tubulações desses circuitos. Durante sua utilização, essas canetas entram em contato com a microbiota oral, o que pode favorecer a formação de biofilme em sua superfície e influir na qualidade e na segurança dos procedimentos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a formação in vitro de biofilme na superfície de canetas odontológicas utilizando-se Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus. Os experimentos foram executados em fragmentos de alumínio provenientesdo corte de canetas odontológicas e a formação do biofilme foi verificada pela contagem de bactérias viáveis (CBV)e por microscopia eletrônica de varredura (MEV). O número de células aderidas atingiu 9 × 106 ufc.cm–2 paraPseudomonas aeruginosa e 6 × 108 ufc.cm–2 para Staphylococcus aureus. A MEV mostrou a adesão de Pseudomonasaeruginosa e Staphylococcus aureus aos fragmentos e a presença de matriz polimérica a partir do sexto dia deincubação. Também foi testada a produção de biofilme por essas bactérias na superfície de placas de poliestireno, pelo método do Cristal Violeta. Ambos os micro-organismos exibiram valores de absorbância superiores ao ponto de corte estabelecido, indicando resultados positivos. Foi demonstrada, ainda, a capacidade de ambas as bactériasproduzirem cápsula, utilizando-se o método do Ágar Vermelho Congo. Nas condições testadas, os experimentosrealizados neste trabalho mostraram a formação in vitro de biofilme na superfície de material proveniente decanetas odontológicas, um evento importante considerando-se que sua presença representa um potencial risco para o estabelecimento de contaminação cruzada.