Los métodos fenotípicos empleados para la identificación de microorganismos dependen de procesos metabólicos que requieren de tiempos de incubación mínimos para alcanzar resultados confiables. La espectrometría de masas MALDI-TOF (desorción/ionización láser asistida por una matriz con detección de masas por tiempo de vuelo) se ha instaurado como una metodología relevante para la identificación de microorganismos mediante el análisis de proteínas, a través de la creación de un espectro de masas específico de género y especie. En esta revisión, se presenta MALDI-TOF MS como una tecnología precisa para la identificación de bacterias, levaduras, mohos, en incluso de virus ,que además, permite la reducción del tiempo para obtener un resultado de identificación, que puede impactar los costos de atención y duración de la estancia hospitalaria. La identificación de microorganismos directamente de muestras biológicas y la detección de mecanismos de resistencia a antimicrobianos, prometen un mayor impacto clínico y epidemiológico con el desarrollo e implementación de esta tecnología en los laboratorios de microbiología clínica.