Estudio del polimorfismo del gen de TNF-α, de dicha citocina, y de MCP-1 en pacientes con queratopatía climática esferoidea
Studies of TNF-α gene polymorphism, TNF-α and MCP-1 cytokines in patients with spheroidal climatic keratopathy
Arch. alerg. inmunol. clin; 44 (3), 2013
Publication year: 2013
Objetivo. Investigar polimorfismo de nucleótidos únicos (SNP) en la posición
-308 (G/A) del gen TNF-α y la participación de las citocinas TNF-α y MCP-1 en pacientes
con queratopatía climática esferoidea (QCE) y en controles sanos.
Materiales y métodos. Participaron 15 pacientes con QCE y 15 individuos
sanos del departamento El Cuy, Provincia de Río Negro. Todos ellos, luego de firmar
el consentimiento informado, recibieron un examen oftalmológico completo
y se recolectaron muestras de sangre y lágrima para realizar diferentes estudios.
EL ADN genómico fue obtenido de sangre de todos los individuos mediante
el método de salting out y posteriormente amplificado y estudiado mediante reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) con el sistema de amplificación refractaria
a la mutación (ARMS). También se investigaron concentraciones de algunas citocinas
proinflamatorias en lágrimas y en sobrenadante de cultivo de células epiteliales
corneales humanas (CECH) tratadas o no con radiación ultravioleta B (RUV-B).
Resultados. Los resultados de SNP en la posición -308 (G/A) del gen TNF-α
(frecuencia alélica y genotípica) indicaron ausencia de diferencias significativas
entre pacientes y controles sanos. Fenotípicamente ambos grupos de individuos
serían bajos o intermedios productores in vitro de la citocina TNF-α. Sin
embargo en las lágrimas de pacientes con QCE se detectaron concentraciones
significativamente superiores de TNF-α, IL-1β y MCP-1 (citocinas proinflamatorias)
que en lágrimas de individuos controles sanos (p<0,0001) En la periferia
y limbo de la córnea las células dendríticas (CD) incrementaron significativamente
con el progreso de la enfermedad (p<0,05). La contribución del epitelio
corneal en el proceso inflamatorio fue investigada utilizando CECH expuestas
o no a 10 mJ/cm2
de RUV-B. A pesar de la presencia de gelatinasas, IL-6 e
IL-8 en sobrenadantes de cultivos obtenidos a las 48 horas (datos no mostrados)
no observamos niveles detectables de TNF-α, IL-1β ni MCP-1.
Conclusión. Este trabajo aporta nuevos datos para aumentar los conocimientos
sobre los mecanismos inmunológicos involucrados en la etiopatogenia y progresión
de la QCE. Demostramos que las citocinas proinflamatorias MCP-1 y TNF-α
están significativamente elevadas en lágrimas de individuos con QCE, como se observó
previamente con IL-1β. MCP-1 sería la responsable del aumento de CD en
córnea periférica y limbo de estos pacientes a medida de que la enfermedad avanza.
El hallazgo de que estas citocinas no pudieron ser detectadas en cultivos de
CECH estresadas con RUV-B implica que otras células son las responsables de su
producción o que además de RUV-B otros factores son necesarios para iniciar esta
cascada de eventos que se observan en esta hipersensibilidad corneal humana(AU)
Purpose. To investigate Single Nucleotide Polymorphism (SNP) at -308 position
(G/A) of TNF-α gen and involving of TNF-α and MCP-1 cytokines in Climatic
Droplet Keratopathy (CDK) patients and healthy controls.
Materials and methods. Fifteen patients with CDK and fifteen healthy
controls from departamento El Cuy, province of Rio Negro were involved
in this study. After informed consent was obtained from all participants, they
had a complete eye examination and then tear and blood samples were collected
to perform different assays. DNA was obtained from blood of all individuals
using the method of “salting out” and then amplified and studied
performing the polymerase chain reaction (PCR) with Amplification-refractory
Mutation System (ARMS). Furthermore, some cytokines concentrations
were measured in tears and supernatants from human corneal epithelial cells
(HCEs) exposed or not to UVR-B radiation.
Results. Analysis from SNP at position -308 (G/A) of TNF-α gen (allelic
and genotypic frequency) showed no significant differences between patients
and healthy controls. Phenotypically both groups of individuals would
be low or intermediate in vitro producers of TNF-α cytokine. However, in
tears from CDK’s patients we detected significantly higher concentrations of
TNF-α, IL-1β and MCP-1 (pro-inflammatory cytokines) than in healthy control
subjects tears (p<0.0001). At the corneal peripheral / limbus area, dendritic
cells (DCs) increased significantly with the progression of the disease
(p<0.05). The corneal epithelium contribution to the inflammatory process
was investigated using HCEs exposed or not to 10 mJ/cm2
of UV radiation–B
(UVR-B). Despite the presence of gelatinases, IL-6 and IL-8 in culture supernatants
obtained after 48 hours (data not shown), detectable levels of TNF-α,
IL-1β and MCP-1 were not detected.
Conclusion. This study provides new insights to increase our knowledge
about the immunological mechanisms involved in the etiopathogenesis and
progression of CDK. We showed that pro-inflammatory cytokines MCP-1 y
TNF-α were significantly increased in tears from CDK’s patients, as previously
described with IL-1β. MCP-1 would be responsible for the increasing
of DCs on the corneal peripheral / limbus area of these subjects as the disease
progresses. The fact that these cytokines could not be detected in cultures
of HCEs stressed with UVR-B implies that other cells are responsible
for their production or, in addition to UVR-B, other factors are necessary to
initiate the cascade of events observed in this human corneal hypersensitivity. (AU)