Mycoplasma é um patógeno altamente contagioso, podendo causar mastite, pneumonia, artrite, entre outras enfermidades. Seu isolamento requer meios e condições específicas devido ao seu crescimento fastidioso. Devido à complexidade do seu diagnóstico, acredita-se que a real prevalência de casos de mastite por micoplasma seja subestimada. O objetivo do presente estudo foi identificar a prevalência de Mycoplasma bovis em diferentes rebanhos de bovinos leiteiros no estado de São Paulo. O estudo foi dividido em fase de triagem, na qual colheram-se amostras de 67 tanques de expansão e a coleta individual, na qual propriedades positivas para M. bovis foram visitadas e colhidas amostras de leite de todos os animais com mastite clínica e subclínica. O diagnóstico laboratorial foi feito por meio da PCR e cultivo microbiológico específico. A prevalência de M. bovis encontrada na fase de triagem foi de 1,4%. Na fase individual, todas as amostras de leite, procedentes de propriedade positiva para M. bovis no tanque de expansão, foram negativas, o que permite concluir pela baixa prevalência do agente nas condições do presente estudo.(AU)