RESUMEN Objetivo Aplicar una técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) múltiple en tiempo real para la detección de Salmonella spp., Listeria monocytogenes y Yersinia enterocolitica, como herramienta de apoyo diagnóstico en la vigilancia de brotes de enfermedad transmitida por alimentos. Materiales y Métodos Se aplicó la metodología molecular en muestras clínicas provenientes de individuos que estaban asociados a brotes de enfermedad transmitida por alimentos de dos departamentos de Colombia. Los resultados se compararon con los datos arrojados por la metodología convencional de cultivo. Adicionalmente a los aislamientos obtenidos se les evaluó relación clonal mediante la técnica de electroforesis de campo pulsado (PFGE). Resultados Se determinó un total de 123 casos de enfermedad transmitida por alimentos de los cuales 45 muestras biológicas fueron confirmadas por laboratorio y 88 mediante nexo epidemiológico. La metodología molecular detectó 35/45 muestras positivas frente a 17/45 muestras positivas detectadas mediante la metodología convencional. La PFGE demostró relación clonal en cada brote. Conclusión Los resultados del estudio demuestran la aplicabilidad de la técnica molecular como herramienta útil de apoyo diagnóstico en la caracterización de brotes de enfermedad transmitida por alimentos, permitiendo una respuesta oportuna y confiable.(AU)