Procedimentos clínicos complementares realizados após o preparo químico-cirúrgico de canais radiculares visam potencializar a limpeza e desinfecção após a fase de preparo. O objetivo deste trabalho foi avaliar, por métodos moleculares baseados em rDNA e rRNA, a eficácia antimicrobiana de procedimentos complementares de primeira e de segunda sessão, realizados após o PQC em dentes com periodontite apical. Baseado em estudo piloto prévio, amostras microbiológicas dos canais radiculares de 20 dentes unirradiculares com periodontite apical foram coletadas na primeira sessão clínica: após a cirurgia de acesso (S1), após o PQC realizado com Sistema Reciproc e NaOCl 2,5% (S2), após a utilização do instrumento XP-endo Finisher (S3a), e após a ativação ultrassônica (S3b). Na segunda sessão clínica as amostras foram coletadas após medicação intracanal entre sessões por 14 dias (S4), e após o repreparo dos canais na segunda sessão de tratamento (S5). As amostras foram submetidas à extração de DNA e RNA. O RNA foi submetido à reação de transcrição reversa (RT-PCR) para confecção da fita dupla de DNA complementar (cDNA). DNA e cDNA foram submetidos a reações de qPCR, com iniciadores universais para a região 16S rRNA do domínio Bacteria. A atividade metabólica das bactérias foi verificada através da relação entre os níveis de rRNA e rDNA das amostras baseados nos dados dos ensaios de qPCR. Os dados foram analisados pelo teste de Wilcoxon para amostras pareadas (p < 0,05). Todas amostras S1 foram positivas para bactérias (mediana: 1,79 x 105 cópias de rDNA). Doze canais (60%) permaneceram infectados em S2, com uma redução significativa de rDNA (mediana: 7,58 x 103; P = 0,0001). Em S3a e S3b, o número de canais infectados reduziu para 11 (55%) e 10 (50%), respectivamente, e aumentou para 14 (70%) em S4; porém não houve diferenças significativas entre os níveis de rDNA bacteriano quando essas amostras foram comparadas às amostras S2 ou comparadas entre si (P > 0,05). A prevalência de canais infectados voltou a cair em S5 para 6 (30%) e o número cópias de rDNA bacteriano detectado reduziu de maneira significativa quando comparado às amostras S4 (p = 0,0061). Nas amostras positivas para os 2 métodos, os níveis de rRNA foram significativamente maiores do que os níveis de rDNA nas amostras S1 (p = 0,0007) e S4 (p = 0,0499), indicando um alto metabolismo bacteriano. A relação dos níveis de rRNA e de rDNA revelou uma redução do metabolismo de bactérias totais em S2, S3a e S3b e um aumento significativo do metabolismo bacteriano em S4 (p = 0,0173) quando comparado a S3b. Concluiu-se que: o PQC promoveu redução dos níveis e da atividade metabólica de bactérias nos canais radiculares; o uso do instrumento XP-endo Finisher e ativação ultrassônica não contribuiu para uma desinfecção adicional na primeira sessão; após o uso de Ca(OH)2 como medicação intracanal, houve um aumento no metabolismo de bactérias persistentes; o repreparo dos canais radiculares após medicação intracanal, na segunda sessão, promoveu maior desinfecção do que os procedimentos realizados na primeira sessão do tratamento de dentes com periodontite apical.