Carbapenemases novas ou emergentes em Pseudomonas aeruginosa
New or emerging carbapenemases in Pseudomonas aeruginosa
Publication year: 2019
Theses and dissertations in Portugués presented to the Universidade de São Paulo. Faculdade de Ciências Farmacêuticas to obtain the academic title of Mestre. Leader: Sampaio, Jorge Luiz Mello
Pseudomonas aeruginosa é um importante agente de infecções relacionadas à assistência à saúde em todo o mundo. O tratamento empírico de infecções graves causadas por esta espécie usualmente inclui os carbapenêmicos. Essa terapia, se inadequada, está relacionada a um aumento significativo da mortalidade. Os principais mecanismos de resistência aos carbapenêmicos em bacilos Gram-negativos são a redução da permeabilidade da membrana externa, hiperexpressão de bombas de efluxo e produção de betalactamases, sendo este último, o mais eficiente. O objetivo deste trabalho consistiu na caracterização de carbapenemases novas ou emergentes e seu contexto genético em P. aeruginosa. Foram utilizados 11 isolados de P. aeruginosa capazes de hidrolisar o imipenem em ensaio espectrofotométrico e negativos para genes de carbapenemases conhecidos e uma cepa produtora de KPC-2. Tais isolados foram submetidos à confirmação do perfil de resistência aos carbapenêmicos pelos métodos de disco-difusão e microdiluição em caldo (CIM), bloqueio enzimático com EDTA e Blue-Carba. O perfil plasmidial foi avaliado utilizando-se os métodos de lise alcalina e eletroforese em campos pulsados (PFGE). Os genomas foram sequenciados utilizando-se o sistema MiSeq. O perfil clonal dos isolados foi avaliado por PFGE e Multilocus Sequence Typing (MLST). Dez isolados apresentaram Blue-Carba negativo, compatível com a presença de carbapenemases fracas. Quatro isolados apresentaram plasmídeos, visualizados em gel de agarose após PFGE. Os plasmídeos do isolado D5303023 foram eletroporados em E. coli TOP 10 e selecionados em meio LB contendo 1µg/mL imipenem, contudo não foram obtidos transformantes. A análise por PFGE identificou sete grupos clonais distintos. Quanto à tipagem por MLST, foi detectado um novo tipo ST3187 e os ST277 e ST1560 foram os predominantes. O isolado D9203039 apresentou uma carbapenemase GES-20 associada a uma betalactamase de espectro estendido GES-19, sendo os genes que as codificam localizados no integron In724. Esse isolado pertence ao ST309, clone de potencial alto risco, associado ao fenótipo de resistência a múltiplos antimicrobianos no México. O genoma da cepa positiva para KPC-2 foi digerido com a S1 nuclease e submetido à PFGE, evidenciando um plasmídeo de aproximadamente 453 kb. Após análise do sequenciamento confirmou-se que a cepa pertence ao ST446 e foi observada a presença do gene blaKPC-2 em um contig de 128.487 bp. Este contig apresentou 99,9% de similaridade com o plasmídeo 1 da cepa P. aeruginosa RW109; no entanto, ensaios de conjugação bacteriana falharam em obter colônias de transconjugantes. O gene blaKPC-2 foi encontrado flanqueado à montante por uma estrutura truncada de um transpóson da família Tn3 e à jusante por uma ISKpn6 truncada. As análises das sequências de DNA das demais cepas evidenciaram a presença de sequências gênicas, que traduzidas, apresentavam similaridade para sete metalobetalactamases (MBL), indicando a potencial presença de novos genes de carbapenemases. Foi caracterizada pela primeira vez no Brasil cepa produtora da carbapenemase GES-20 e o novo ST3187. Foram detectados potenciais novos genes de carbapenemases. O gene blaKPC-2 no isolado J5083553 tem provável localização plasmidial
Pseudomonas aeruginosa is a major agent of healthcare-related infections worldwide. Empirical treatment of serious infections caused by this species usually includes carbapenems. This therapy, if inadequate, is related to a significant increase in mortality. The main mechanisms of carbapenem resistance in Gram-negative bacteria are the reduction of outer membrane permeability, overexpression of efflux pumps and beta-lactamase production, the latter being the most efficient. The aim of this work was the characterization of new or emerging carbapenemases and their genetic context in P. aeruginosa. Eleven P. aeruginosa isolates capable of hydrolyzing imipenem in spectrophotometric assay and negative for known carbapenemases genes were used, as well as a KPC-2 producing strain. These isolates were subjected to confirmation of carbapenem resistance profile by disk diffusion, broth microdilution (MIC) and enzyme inhibition by EDTA and Blue-Carba methods. Plasmid profile was evaluated using alkaline lysis and pulsed field electrophoresis (PFGE) methods. Genomes were sequenced using the MiSeq system. The clonal profile of the isolates was evaluated by PFGE and Multilocus Sequence Typing (MLST). Ten isolates presented negative Blue-Carba, compatible with the presence of weak carbapenemases. Four isolates presented plasmids visualized on agarose gel after PFGE. The plasmids of isolate D5303023 were electroporated into E. coli TOP 10 and selected in LB medium containing 1 µg/mL imipenem, however no transformants were obtained. The PFGE analysis identified 7 distinct clonal groups. As for MLST typing, a new type ST3187 was detected and the ST277 and ST1560 were the predominant types. The genome of the KPC-2 positive strain was digested with S1 nuclease and subjected to PFGE, evidencing a plasmid of approximately 453 kb. Isolate D9203039 presented a GES-20 carbapenemase associated with a GES-19 extended spectrum beta-lactamase. The genes encoding them were located in the In724 integron. This isolate belonged to ST309, a potential high risk clone, associated with the multidrug resistant strain in Mexico. After sequencing it was confirmed that the strain belongs to ST446 and it was observed the presence of the blaKPC-2 gene in a contig of 128,487 bp. This contig was 99.9% similar to plasmid 1 of the P. aeruginosa RW103 strain. However, bacterial conjugation assays failed to obtain transconjugant colonies. The blaKPC-2 gene was found flanked upstream by a truncated structure of a Tn3 family transposon and downstream by a truncated ISKpn6. DNA sequence analysis of the other strains showed the presence of gene sequences, which translated, showed similarity to seven metallo-beta-lactamases (MBL), indicating the potential presence of new carbapenemase genes. It was characterized for the first time in Brazil carbapenemase producing strain GES-20 and the new ST3187. Potential new carbapenemase genes were detected. The blaKPC-2 gene in isolate J5083553 has plasmid localization