O câncer colorretal apresenta a quarta maior taxa de mortalidade relacionada ao câncer no mundo, a qual está intimamente ligada ao desenvolvimento de metástase. No início do processo de malignização, células epiteliais sofrem desregulação da adesão célulacélula, que leva ao desenvolvimento da transição epitélio-mesenquimal. O sistema de adesão célula-célula é mantido pelo complexo juncional apical, constituído pelas junções tight e aderentes, que desempenha um importante papel na homeostase epitelial, regulando diversos eventos, como proliferação, diferenciação e sinalização celular. Neste contexto, a desregulação funcional das claudinas e E-caderina, principais componentes das junções tight e aderentes respectivamente, desempenha um papel crucial no aumento do potencial tumorigênico de diversos tipos de tumores epiteliais. No presente estudo, foi avaliado o papel das vias de sinalização ativadas pelo fator de crescimento epidermal na modulação da expressão e função das claudinas, assim como o envolvimento da Na,K-ATPase e vias de sinalização downstream na regulação do complexo juncional apical utilizando o glicosídio ouabaína, conhecido por inibir a Na,KATPase, sendo esses eventos relacionados com a progressão do câncer colorretal. Inicialmente, mostramos que o fator de crescimento epidermal aumentou a expressão da claudina-3 em células de adenocarcinoma colorretal HT-29, evento relacionado ao aumento da migração celular e formação de colônias dependente e independente de ancoragem. Observamos ainda que as vias de sinalização ERK1/2 e PI3K-Akt estão envolvidas na modulação destes efeitos, visto que a inibição farmacológica das mesmas bloqueou estes eventos. Através de manipulação genética, mostramos também que a superexpressão da claudina-1 resultou na diminuição da migração celular; contudo, a superexpressão da claudina-3 não alterou o potencial migratório das células. Além disso, a superexpressão da claudina-3, mas não da claudina-1, desregulou a função de barreira das junções tight, aumentando o fluxo paracelular de macromoléculas. De maneira adicional, um aumento na formação de colônias dependente e independente de ancoragem foi observado em células que superexpressavam claudina-3, enquanto nenhuma mudança no potencial de formação de colônias foi observada em células que superexpressavam a claudina-1. Em seguida, demonstramos que o tratamento com a ouabaína resultou na redução dos níveis protéicos da β1 Na,K-ATPase e redistribuição celular das proteínas de junção aderente E-caderina e β-catenina, assim como da α1 Na,K-ATPase. Além disso, a ouabaína aumentou os níveis protéicos da claudina-3, desregulando a função de barreira das junções tight e aumentou a viabilidade e proliferação celular, durante períodos iniciais de tratamento. De forma adicional, observamos que os eventos induzidos por ouabaína foram dependentes da ativação da via de sinalização ERK1/2, mas, em contraste a estudos anteriores, esta cascata de sinalização foi independente da presença de caveola. Em conclusão, nossos dados ajudam no melhor entendimento sobre as vias de sinalização envolvidas com a desregulação do complexo juncional apical durante a progressão do câncer colorretal. Além disso, os resultados do nosso estudo pode constituir uma base para postular possíveis alvos moleculares para futuras aplicações terapêuticas no tratamento deste tipo de câncer.