Aminoglicosídeos como agentes de restauração de mutações inativadoras no gene BRCA1

Abreu, Renata Vahia de

As mutações em BRCA1 são responsáveis pela maioria dos casos de câncer da síndrome hereditária de câncer de mama e ovário (SHCMO). As mutações sem sentido são caracterizadas pelo aparecimento de um códon de parada prematura que dá origem a uma proteína truncada. Esses variantes representam ~12% das mutações no gene BRCA1 e seus portadores são mais propensos a desenvolverem câncer de mama e ovário. Para esses indivíduos pouco pode ser feito para uma significativa redução do risco de câncer além de rotinas periódicas de monitoramento e cirurgias profiláticas. A supressão do códon de parada prematura potencialmente restauraria a função da proteína. Diversos estudos demonstraram que os aminoglicosídeos são capazes de induzir transleitura de códons de parada prematura, gerando, em alguma extensão, proteínas com sua função biológica restaurada. Devido à carência de alternativas para o tratamento de SHCMO, o uso de aminoglicosídeos pode representar uma importante estratégia na prevenção do câncer hereditário de mama e ovário associado a mutações sem sentido. Esse estudo se propôs a avaliar o uso de aminoglicosídeos como agentes de restauração de variantes sem sentido do gene BRCA1. Para tal, foram selecionados variantes naturais de BRCA1 que apresentam códon de parada prematura. Os variantes foram gerados por rotinas de mutagênese sitio-dirigida e clonados no vetor retroviral pQCXIH, em fusão com EGFP ou GAL4DBD. Linhagens de células humanas (células HeLa) foram desenvolvidas de forma a expressarem estavelmente essas construções. Os ensaios de citotoxicidade foram realizados para diferentes aminoglicosídeos (G418, gentamicina, higromicina B e puromicina) em células da linhagem HeLa. Os resultados sugerem que todos os aminoglicosídeos avaliados possuem toxicidade limitada em células HeLa, permitindo o uso de concentrações apropriadas nos ensaios de transleitura in vitro.

Os níveis proteicos de BRCA1:

EGFP foram avaliados em células humanas estáveis tratadas ou não com G418 por (a) microscopia confocal, (b) citometria de fluxo e (c) western blotting e imunodetecção. A restauração dos níveis proteicos foi observada 48 horas após o tratamento com G418 por microscopia confocal e citometria de fluxo. No entanto, não foi possível identificar a presença da proteína quimérica por western blotting e imunodetecção, provavelmente devido ao limite de sensibilidade da técnica. Esses dados sugerem que o fármaco G418 é capaz de restabelecer a síntese da proteína cadeia completa de variantes sem sentido de BRCA1.

Ensaios de ativação transcricional serão conduzidos utilizando as construções GAL4:

BRCA1 para avaliar a restauração funcional da proteína e validar os dados previamente obtidos nesse modelo. No geral, esse é o primeiro estudo que avalia a transleitura de variantes de BRCA1 com códon de parada prematura; um gene de relevância clínica para o câncer de mama e ovário.

Mutations in BRCA1 are responsible for most cases of hereditary breast and ovarian cancer syndrome (HBOC). Nonsense variants are characterized by a premature stop codon that leads to an inactive truncated protein. These variants account for ~ 12% of germ line mutations in the BRCA1 gene and the carriers are highly prone to develop breast and ovarian cancer. For these individuals little can be done to a significant reduction in the cancer risk besides periodic monitoring routine and prophylactic surgeries. The suppression of a premature stop codon potentially restores the function of the protein. Different studies have shown that aminoglycosides induce premature stop codons readthrough and, at least in part, bring forth proteins with restored biological function. Given the lack of alternatives to HBOC treatment, the use of aminoglycosides may represent an important strategy for the prevention of hereditary breast and ovarian cancer associated with nonsense mutations. Our study intends to evaluate the use of aminoglycosides on the restoration of nonsense variants of the BRCA1 gene. Therefore, naturally occurring BRCA1 variants encoding different premature stop codons were selected for the study. They were generated by site-directed mutagenesis and cloned into pQCXIH, a retroviral vector, as a fusion with EGFP or GAL4DBD. Human cell lines (HeLa cells) stably expressing these constructs were developed. Cytotoxicity assays for different aminoglycosides (G418, gentamicin, hygromycin B and puromycin) were performed in HeLa cells. Our findings suggest that all aminoglycosides assayed show limited toxicity, allowing proper concentrations for in vitro readthrough assays. Thus, BRCA1:EGFP protein levels were evaluated on G418 treated and non-treated human stably expressing cells by: (a) confocal microscopy, (b) flow cytometry and (c) immunoblotting. Protein restoration was observed after 48h G418 treatment by both microscopy and flow cytometry analysis. However, we were not able to detect protein restoration by immunoblotting, probably due to the limited sensitivity. These data suggest that G418 can restore full-length protein synthesis in human cells encoding BRCA1 nonsense variants.

Transcription activation assays will be performed using the GAL4:

BRCA1 pQCXIH constructs to access protein functional restoration and validate this approach. Overall, this is the first study that evaluates the readthrough of premature stop codon variants with clinical relevance in the breast and ovarian cancer predisposing gene BRCA1.