Toxoplasma gondii em amostras de água de reuso: proposta de método de detecção e quantificação por PCR quantitativo em tempo real (qPCR)
Toxoplasma gondii in water samples for reuse: proposal for a method of detection and quantification by quantitative real-time PCR (qPCR)
Publication year: 2020
Theses and dissertations in Portugués presented to the Universidade de São Paulo. Faculdade de Saúde Pública to obtain the academic title of Doutor. Leader: Razzolini, Maria Tereza Pepe
Resumo - O reuso de água contribui nos âmbitos ambientais, sociais e econômicos. Entretanto a presença de parasitos em amostras hídricas tem sido evidenciada por diferentes estudos, entre eles Toxoplasma gondii. A ausência de uma metodologia padronizada para detecção de oocistos em amostras hídricas, dificulta a caracterização das mesmas, comprometendo a elaboração de uma legislação. Tendo em vista a importância do reuso da água na mitigação da escassez, do stress hídrico e diante dos desafios expostos é que o presente trabalho se insere. Objetivos - Propor técnica de concentração e recuperação de oocistos em água de reuso; propor método de extração de DNA; detectar e quantificar oocistos por qPCR. Método - Utilizando o método 1693/2014 USEPA, foram concentrados 30 L de água de reuso de 20 amostras provenientes de duas ETE's da cidade de São Paulo, Brasil. Os 15 mL resultantes desse processo foram concentrados em membrana 0,45µm. O material filtrado na membrana foi recuperado por raspagem com alça bacteriológica de 10 µL.
Para extração de DNA foram empregadas duas técnicas:
o kit comercial DNeasy PowerSoil Kit® otimizado com a enzima Zymolyase® e choque térmico. A quantificação de DNA foi realizada com a sequência alvo B1. Resultados - Na extração por choque-térmico não foi detectado DNA nas vintes amostras realizadas. Das 16 amostras submetidas à extração enzimática, quatro foram consideradas positivas. Discussão - A extração de DNA consistiu na etapa essencial para detecção e quantificação de oocisto, dado a natureza resistente das paredes. Conclusão - O reuso de água pode ser comprometido na ausência de um protocolo padronizado de detecção e quantificação de oocisto de T. gondii, que possibilite a determinação de parâmetros parasitológicos para elaboração de uma legislação.
Abstract - The wastewater reuse contributes in the environmental, social and economic spheres. However, the presence of parasites in water samples has been evidenced by different studies, including Toxoplasma gondii. The absence of a standardized methodology for detecting oocysts in water samples makes it difficult to characterize them, compromising the drafting of legislation. In view of the importance of wastewater reuse in mitigating water scarcity and stress and in view of the challenges presented, this work is inserted. Objectives - To propose oocyst concentration and recovery techniques in wastewater reuse; propose DNA extraction method; detect and quantify oocysts by qPCR. Method - Using method 1693/2014 USEPA, 30 L of wastewater reuse from 20 samples from two WWTPs in the city of São Paulo, Brazil, were concentrated. The 15 mL resulting from this process were concentrated in a 0.45 µm membrane. The material filtered on the membrane was recovered by scraping with a 10 µL bacteriological loop. For DNA extraction, two techniques were used: the commercial kit DNeasy PowerSoil Kit® optimized with the enzyme Zymolyase® and freeze - thaw. DNA quantification was performed with the target sequence B1. Results - In freeze - thaw extraction, no DNA was detected in the 20 samples performed. Of the 16 samples submitted to enzymatic extraction, four were considered positive. Discussion - DNA extraction was the essential step for oocyst detection and quantification, given the resistant nature of the walls. Conclusion - Wastewater reuse can be compromised in the absence of a standardized protocol for the detection and quantification of T. gondii oocysts, that allows the determination of parasitological parameters for the elaboration of legislation.