Diagnóstico molecular de larvas de Angiostrongylus spp. recuperadas de gastrópodes

Mattos, Aline Carvalho de

Gastrópodes continentais atuam como hospedeiros intermediários de nematódeos de interesse para a saúde humana e animal, como Angiostrongylus spp. e outros pertencentes à superfamília Metastrongyloidea. O procedimento de digestão artificial é comumente utilizado para recuperar larvas de nematódeos em moluscos. Entretanto, essas formas imaturas não apresentam desenvolvidos os caracteres morfológicos necessários à sua identificação taxonômica. Como o produto da digestão artificial é ácido e contém restos de tecido do molusco, também surgem dificuldades para realizar o diagnóstico molecular destas larvas. Estudos pilotos mostraram ineficiência no diagnóstico molecular devido a variações na qualidade da amostra, baixa concentração de DNA e baixa eficiência nas Reações em Cadeia da Polimerase (PCR). O objetivo deste trabalho foi aprimorar o diagnóstico molecular de larvas de Angiostrongylus spp. obtidas de moluscos. Assim, inicialmente, foi padronizado um método de preparo das larvas (triagem das larvas com micropipeta, somado ao ajuste do pH com PBS 1X ). A partir destas amostras padronizadas quanto ao método de preparo, foram testados métodos de extração de DNA e diferentes iniciadores para a região do Citocromo c Oxidase subunidade I (COI). Foram utilizadas larvas L3 de Angiostrongylus cantonensis, A. costaricensis e A. vasorum provenientes de ciclos mantidos em laboratório.

Amostras do campo de Aelurostrongylus abstrusus também foram utilizadas para comparação. A importância do preparo da amostra foi testada através de reações de PCR realizadas em condições idênticas, com amostras padronizadas e não padronizadas quanto ao preparo. Quanto aos testes de extração, após a realização de pilotos com diferentes protocolos, foram selecionados para testes comparativos, até a etapa de sequenciamento, dois protocolos com choque térmico e um utilizando kit comercial. Estes foram avaliados quanto à quantidade de DNA, eficiência da amplificação, tempo de realização e qualidade da sequência. Em uma terceira etapa foram testados três diferentes iniciadores para o COI. Os resultados demonstraram que após uma lavagem com PBS o produto da digestão artificial torna-se neutro (pH 7,29 ± 0,13) e que estas amostras, devidamente triadas, apresentam taxa de amplificação 60% maior. Este passo mostrou-se essencial para o sucesso das demais etapas. As amostras que foram submetidas à extração de DNA com os três protocolos selecionados resultaram em um produto que permitiu a amplificação do fragmento do COI nas reações de PCR, apesar das baixas concentrações de DNA, tendo sido possível também o diagnóstico molecular, por sequenciamento de Sanger, de 100% dessas amostras.

Os protocolos com choque térmico apresentaram menor tempo de execução, custo e geração de resíduo químico. Os três iniciadores testados amplificaram com eficiência a região-alvo, viabilizando a identificação de Angiostrongylus spp. por sequenciamento. Os diferentes métodos de extração e iniciadores testados representam diferentes possibilidades para o diagnóstico de larvas de Angiostrongylus spp. e seu uso deverá levar em conta os recursos disponíveis (tempo e dinheiro) e o objetivo do estudo (diagnóstico ou pesquisa). A disponibilização de um protocolo eficiente e a possibilidade de redução dos custos no diagnóstico dos nematódeos associados a moluscos contribuem para incentivar as pesquisas na área e viabilizar estudos de vigilância epidemiológica e controle das angiostrongilíases. (AU)