Ao longo de sua vida útil, instrumentais cirúrgicos são submetidos a sucessivos ciclos de contaminação e processamento. A presença em áreas de difícil acesso, como serrilha e cremalheira, assim como a adoção de práticas inadequadas, durante a prélimpeza e a limpeza, pode dificultar a remoção de resíduos a cada reúso, favorecendo a formação de biofilme. Amplamente isolados como contaminantes de instrumentais cirúrgicos, após o uso, Staphylococcus epidermidis são reconhecidos pela sua capacidade de formar biofilme em diferentes superfícies. Neste sentido, questiona-se: como os métodos de limpeza manual e automatizada atuam na remoção de S. epidermidis aderido à superfície de instrumental cirúrgico submetido à contaminação experimental por diferentes intervalos? Objetivou-se comparar dois protocolos de limpeza, manual e automatizada, quanto à capacidade de remoção de S. epidermidis da superfície de instrumental cirúrgico submetido a diferentes intervalos de contaminação. Tratou-se de uma pesquisa experimental, realizada no Laboratório de Microbiologia Oral e Anaeróbios do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (ICB/UFMG) e no centro de microscopia da UFMG. Foram selecionadas pinças do tipo crile reta, para a análise de áreas com diferentes desafios ao processo de limpeza: superfície irregular (serrilha e cremalheira) e lisa (haste). Os corpos de prova foram contaminados por imersão em Triptical Soya Broth (TSB), contendo 106 UFC/mL de uma amostra clínica de S. epidermidis. A aderência bacteriana, logo após a contaminação e a capacidade de remoção desses microrganismos, submetidos à limpeza manual ou automatizada, foram verificadas depois de uma, duas, quatro, seis, oito e 12 horas. Os resultados foram avaliados por meio de cultura microbiológica e pela microscopia eletrônica de varredura (MEV). A análise dos resultados ocorreu pelo emprego de técnicas de estatística descritiva e análise de variância (ANOVA) em nível de confiança de 5%. No grupo submetido à contaminação, a carga bacteriana apresentou aumento, ao longo do tempo, variando entre 101–102 UFC/cm2 após uma hora e 104 UFC/cm2 em 12 horas. Verificou-se aderência bacteriana, depois de uma hora, com a formação de biofilme após duas horas e, em geral, um aumento na concentração de microrganismos nos tempos subsequentes. A carga microbiana foi reduzida em 1-2 log10 após limpeza manual e entre 1-3 log10 depois de limpeza automatizada, sendo significativa (p<0,05) em todos os fragmentos e tempos avaliados neste último grupo. A análise, por meio de MEV, demostrou a permanência de biofilme após ambos os métodos. Em geral, fragmentos de haste apresentaram menor carga microbiana, nos diferentes grupos avaliados, sendo essa diferença significativa (p<0,05) ao tempo de seis horas. Concluiu-se que S. epidermidis apresentou a capacidade de aderência rápida levando à formação de biofilme após duas horas de contato com o instrumental cirúrgico com carga bacteriana de 102 UFC/cm2. A limpeza automatizada foi mais efetiva que a limpeza manual, contudo nenhum dos métodos removeu o biofilme formado completamente. As condições de pré-limpeza, bem como a presença em áreas de difícil acesso, como cremalheira e serrilha, são fatores críticos à qualidade do processamento de instrumentais cirúrgicos.