Introdução. Conhecer a cultura de segurança do paciente estabelecida nas organizações de saúde torna-se o primeiro passo para estabelecer o diagnóstico e o planejamento de ações que promovam mudanças e fortaleçam essa cultura, com vistas a mitigar a incidência de eventos adversos, garantindo, assim, uma assistência qualificada e mais segura aos pacientes. Cultura de segurança é definida como o conjunto de valores e padrões comportamentais de indivíduos e de grupos que determina a maneira como estes realizam seu trabalho. Daí a importância de se compartilhar uma cultura de segurança do paciente positiva, uma vez que a ausência desta aumenta a probabilidade de incidentes relacionados com os cuidados em saúde. Objetivos. Avaliar a cultura de segurança do paciente estabelecida em um hospital público de ensino, segundo a percepção subjetiva dos profissionais de saúde; examinar as dimensões da cultura de segurança do paciente por categorias profissionais e por unidades hospitalares; comparar as dimensões da cultura de segurança do paciente entre as categorias profissionais e unidades/áreas hospitalares; categorizar e analisar as percepções dos profissionais sobre a segurança, confrontando-as com as dimensões da cultura de segurança do paciente. Método. Estudo descritivo-exploratório de natureza quantitativa, do tipo survey transversal, realizado em um hospital público de ensino de Mato Grosso do Sul. A amostra foi constituída de 397 profissionais da área de saúde que possuíam vínculo empregatício com o hospital. O instrumento de coleta de dados foi o Hospital Survey on Patient Culture (HSOPSC), no qual se emprega a escala de Likert para examinar doze dimensões de cultura de segurança do paciente, sete das quais estão relacionadas com as unidades/áreas do hospital, três estão relacionadas com o hospital e duas são variáveis de resultado. Para a análise estatística dos dados, utilizou-se o software Hospital Data Entry and Analysis Tool, disponibilizado pela Agency for Healthcare Research and Quality (AHRQ). Resultados. Nenhuma dimensão da cultura de segurança do paciente foi, classificada como área de pontos fortes ou positiva. As dimensões com maiores percentuais de respostas positivas foram trabalho em equipe dentro das unidades/áreas (64%); expectativas sobre o supervisor/chefe e ações promotoras de segurança do paciente (58%); e aprendizado organizacional/melhoria contínua (62%). As demais dimensões avaliadas apresentaram percentuais de respostas positivas, classificadas como áreas frágeis da cultura de segurança do paciente. Quanto às variáveis de resultado da cultura de segurança, a que busca conhecer o número de eventos relatados nos últimos 12 meses teve maior percentual (74%), com a resposta nenhum evento notificados nos últimos 12 meses; enquanto que a variável que busca conhecer a nota geral de segurança obteve maior percentual (47%), com a nota aceitavel. Conclusões. Pode-se inferir que, na cultura de segurança do paciente no hospital pesquisado, mesmo áreas classificadas como neutras e frágeis apresentam potencial para se fortalecerem, uma vez que há dimensões com percentuais positivos em alguns dos itens que as compõem. Outros aspectos favoráveis ao fortalecimento da área de segurança são a configuração sociodemográfica dos profissionais, composta de adultos jovens com previsão de aposentadoria mais distante, e o vínculo trabalhista proposto pela empresa gestora do hospital. Esses fatores devem ser considerados pelos dirigentes do hospital como contribuintes da reconstrução de valores, missão e filosofia na cultura organizacional, de modo a contemplar a qualidade e segurança do paciente. Essa repaginação da cultura organizacional do hospital deverá vir acompanhada do estabelecimento de plano de ações e metas de segurança do paciente pelos líderes das unidades/áreas assistenciais, com vistas a construir uma cultura organizacional voltada para a segurança do paciente.