Efeito do glicerofosfato de cálcio, associado ou não ao fluoreto, na fisiologia, estrutura, composição da matriz, células cultiváveis, pH e nas concentrações de fluoreto, cálcio e fosfato de biofilmes misto de S. mutans e C. albicans

Souza, Thamires Priscila Cavazana

O presente estudo teve como objetivo verificar o efeito do glicerofosfato de cálcio (CaGP), associado ou não ao fluoreto (F), na fisiologia, pH e componentes da biomassa e fluido de biofilmes mistos contendo Streptococcus mutans e Candida albicans, formados in vitro. Para formação dos biofilmes colocou-se uma suspenção (1×107 células/mL de C. albicans + 1×108 células/mL de S. mutans) em saliva artificial, suplementada com sacarose, em poços de placas de microtitulação. A cada 24 horas, metade do conteúdo da saliva artificial era renovado. Após os períodos de 72, 78 e 96 horas de formação, os biofilmes recebiam tratamentos, por um minuto, com soluções contendo CaGP (0.125, 0.25 ou 0.5%) com ou sem 500 ppm F, e soluções contendo somente F (500 e 1100 ppm F), adotadas como controles positivos, e saliva artificial, considerada como controle negativo. Para estudo da fisiologia microbiológica, após o terceiro tratamento foram realizados os testes de quantificação de células cultiváveis, biomassa total (teste colorimétrico de cristal violeta), atividade metabólica (redução de XTT), análise estrutural do biofilme (microscopia eletrônica de varredura) e quantificação dos componentes da matriz extracelular (proteína, carboidrato e DNA). Todos os ensaios foram realizados em triplicata, em três ocasiões diferentes. Os resultados foram submetidos à análise de variância a um critério, seguida pelo teste Fisher LSD (p<0.05). Para estudo de pH e componentes do biofilme, após o período de tratamento, foram analisados F, cálcio (Ca) e fósforo (P) no biofilme total e no fluido do biofilme após a mensuração do pH do biofilme. Em outro conjunto de experimentos, após o terceiro tratamento, o biofilme foi exposto, por 3 minutos, à solução de sacarose a 20%. Esta foi removida e, após 1 minuto, analisou-se o pH do meio e as concentrações de F, Ca, e P tanto na biomassa como no fluido do biofilme. Todos os ensaios foram realizados em triplicata, em três ocasiões diferentes. Os dados foram submetidos à análise de variância a dois critérios, seguida pelo teste de Fisher LSD (p<0.05). O CaGP, independente da sua concentração, reduziu significativamente o número de células bacterianas em comparação com o controle negativo. CaGP + F aumentaram a biomassa e a atividade metabólica do biofilme e reduziram os componentes da matriz extracelular avaliada. Os tratamentos com CaGP e 500 ppm F levaram aos maiores valores de pH e concentrações de F e Ca da biomassa do biofilme, antes e após a exposição à sacarose. CaGP, sem F, levou a maiores concentrações de Ca e P no fluido do biofilme. Assim, é possível concluir que o CaGP interfere na biomassa, metabolismo, composição orgânica e inorgânica, bem como no pH do biofilme testado. Essas informações contribuem para o conhecimento de como CaGP atua na dinâmica de um biofilme relacionado com a doença cárie(AU)

The aim of the present study was to evaluate the effect of calcium glycerophosphate (CaGP), associated or not to fluoride (F), on the physiology, pH and components of biofilm biomass and fluid of dual-species biofilms of Streptococcus mutans and Candida albicans, formed in vitro. For the formation of biofilms, a suspension was placed (1×107 cells/mL C. albicans + 1×108 cells/mL S. mutans) in artificial saliva, supplemented with sucrose, in wells of microtiter plates. Every 24 hours, half of the artificial saliva content was renewed. At 72, 78 and 96 hours after the beginning of formation, biofilms were treated for one minute with solutions containing CaGP (0.125, 0.25 ou 0.5%) with or without 500 ppm F, and solutions containing only F (500 and 1100 ppm F), adopted as positive controls, and Artificial Saliva, considered as the negative control. For the study of microbiological physiology, after the third treatment, tests were performed: quantification of cultivable cells, total biomass (colorimetric crystal violet test), metabolic activity (XTT reduction), structural analysis of the biofilm (scanning electron microscopy) and quantification of matrix components (protein, carbohydrate and DNA). All assays were performed in triplicate on three different occasions. The results were submitted to one-way analysis of variance, followed by the Fisher LSD’s test (p<0.05). For the study of pH and biofilm components, after the last treatment, F, calcium (Ca) and phosphorus (P) were analyzed in the total biofilm and in the biofilm fluid after measuring the biofilm pH. In another set of experiments, after the third treatment, the biofilms were exposed for 3 minutes to 20% sucrose solution. This was removed and after 1 minute the biofilms were collected, and the pH of the medium and F, Ca, and P concentrations were determined both in the biomass and in the biofilm fluid. All assays were performed in triplicate on three different occasions. Data were submitted to two-way analysis of variance, followed by Fisher LSD's test (p<0.05). CaGP, regardless of their concentration, significantly reduced the number of bacterial cells compared to the negative control. CaGP + F increased the biomass and metabolic activity of the biofilm and reduced the components of the extracellular matrix evaluated. Treatments with CaGP and 500 ppm F led to the highest pH values and F and Ca concentrations of the biofilm biomass, both before and after sucrose exposure. CaGP, without F, led to higher Ca and P concentrations in the biofilm fluid. Thus, it is possible to conclude that CaGP interferes in the biomass, metabolism, organic and inorganic composition and the pH of the biofilm tested. This information contributes to the knowledge of how CaGP acts in the dynamics of a biofilm related to caries disease(AU)