Avaliação de ensaios moleculares In House para detecção do DNA proviral do HIV-1
Evaluation of In-House molecular assays for detection of HIV-1 proviral DNA
Publication year: 2023
Theses and dissertations in Portugués presented to the Coordenadoria de Controle de Doenças. Programa de Pós-graduação em Ciências to obtain the academic title of Mestre. Leader: Luís Fernando de Macedo Brígido
O diagnóstico pediátrico precoce da infecção pelo HIV-1 é imprescindível, pois
permite o início do tratamento adequado que por sua vez reduz a morbidade e
mortalidade, no entanto, a presença de imunoglobulinas maternas em menores de
18 meses dificulta o diagnóstico, sendo necessária a realização do diagnóstico
através de testes moleculares, como a quantificação do RNA viral ou detecção do
DNA proviral. O DNA proviral do HIV-1 é um marcador crítico para diagnóstico
precoce da transmissão vertical. Uma PCR em tempo real (qPCR) in house fornece
uma alternativa atraente aos ensaios comerciais atualmente disponíveis. O objetivo
do estudo foi avaliar o desempenho de uma qPCR qualitativo para detecção do DNA
proviral do HIV-1. A qPCR, sistema TaqMan, avaliada teve com alvo as regiões da
Integrase (IN) e Terminal repetido longo (LTR) do HIV-1 e o gene CCR5 como
controle interno. Visando aumentar a sensibilidade da qPCR, um Nested qPCR foi
desenvolvido (alvo IN e CCR5). Células ACH-2, que contém um único genoma
proviral do HIV-1, foram utilizadas para construção da curva padrão e padronização
dos ensaios. A avaliação da sensibilidade e especificidade diagnóstica da qPCR foi
realizada utilizando 125 amostras clínicas (n=102 amostras indivíduos infectados,
confirmados HIV-1 positivo pelo histórico de CV e n= 23 amostras de indivíduos não
infectados). O desempenho do Nested qPCR foi avaliado em 69/125 amostras
clinicas. A qPCR apresentou eficiência satisfatória para todos os alvos testados (IN =
99%, CCR5 = 97% e LTR = 107%, R2 >0,99), limite de detecção de 40
cópias/reação do DNA proviral do HIV-1, sensibilidade de 87,2% e especificidade de
100%. No Nested qPCR o uso de uma etapa de amplificação adicional possibilitou o
aumento da sensibilidade do ensaio, 30 cópias/reação do DNA proviral HIV-1 pode
ser detectada. Os ensaios avaliados demostraram ser capaz de detectar o DNA
proviral do HIV-1, com elevada especificidade, sensibilidade, aplicável a uma gama
de pacientes com diferentes níveis de CV plasmática e capaz de detectar uma
variedade de subtipos e CRFs do HIV-1, demostrando ser adequado para o
diagnóstico pediátrico precoce e para implementação em locais com recursos
limitados.
Early pediatric diagnosis of HIV-1 infection is essential, as it allows the initiation of
appropriate treatment, which in turn reduces morbidity and mortality. However, the
presence of maternal immunoglobulins in children under 18 months of age makes
diagnosis difficult, making it necessary to diagnosis through molecular tests, such as
quantification of viral RNA or detection of proviral DNA. HIV-1 proviral DNA is a
critical marker for early diagnosis of vertical transmission. An in-house real-time PCR
(qPCR) provides an attractive alternative to currently available commercial assays.
The objective of the study was to evaluate the performance of a qualitative qPCR for
detecting HIV-1 proviral DNA. The qPCR, TaqMan system, evaluated targeted the
Integrase (IN) and Long Terminal Repeat (LTR) regions of HIV-1 and the CCR5 gene
as an internal control. Aiming to increase the sensitivity of qPCR, a Nested qPCR
was developed (target IN and CCR5). ACH-2 cells, which contain a single HIV-1
proviral genome, were used to construct the standard curve and standardize the
assays. The assessment of the diagnostic sensitivity and specificity of qPCR was
carried out using 125 clinical samples (n=102 samples from infected individuals,
confirmed HIV-1 positive by CV history and n= 23 samples from uninfected
individuals). The performance of Nested qPCR was evaluated on 69/125 clinical
samples. qPCR showed satisfactory efficiency for all tested targets (IN = 99%, CCR5
= 97% and LTR = 107%, R2 >0.99), detection limit of 40 copies/reaction of HIV-1
proviral DNA, sensitivity of 87.2% and specificity of 100%. In Nested qPCR, the use
of an additional amplification step made it possible to increase the sensitivity of the
assay, 30 copies/reaction of HIV-1 proviral DNA can be detected. The assays
evaluated demonstrated that they were capable of detecting HIV-1 proviral DNA, with
high specificity and sensitivity, applicable to a range of patients with different plasma
VL levels and capable of detecting a variety of HIV-1 subtypes and CRFs,
demonstrating be suitable for early pediatric diagnosis and for implementation in
resource-limited settings.