Avaliação funcional do silenciamento por siRNA de P-gp em linhagens de glioblastoma e investigação do potencial papel de P-gp como biomarcador nesse tumor

Heming, Carlos Eduardo Pilotto

O fenômeno conhecido como multidrug resistance (MDR) observado no câncer é um grande desafio na busca por terapias mais eficientes. Esse fenótipo é o resultado da combinação de vários fatores, como a alta expressão de bombas de efluxo da superfamília de proteínas transportadoras ABC, que impedem o acúmulo de quimioterápicos dentro das células tumorais. A expressão de proteínas ABC como a P-gp, codificada pelo gene Abcb1, é frequentemente associada a um prognóstico ruim em vários tumores, incluindo o glioblastoma (GB). Assim, este projeto tem como objetivo investigar as funções desse transportador (além de seu conhecido envolvimento em MDR) na malignidade do GB, avaliando seu envolvimento nas capacidades de sobrevivência, migração e regulação da apoptose, bem como seu potencial como biomarcador em GB via biópsia líquida. Para isso, a expressão de P-gp foi reduzida via siRNA e a presença de cfRNA de P-gp foi avaliada no plasma de pacientes com GB. Os resultados demonstraram, após testes em diferentes linhagens celulares, uma diminuição significativa na viabilidade celular verificada por MTT após o silenciamento de P-gp, além de uma possível relação do transportador com o aumento da apoptose visto que, seu silenciamento aumentou significativamente a população apoptótica induzida pela privação de soro medida usando o kit Caspase-Glo® 3/7. Por outro lado, nossos resultados do ensaio de scratch não mostraram alterações significativas nos padrões migratórios de GB. Em relação à biópsia líquida, o RNA foi extraído do plasma de pacientes diagnosticados com GB e os níveis de P-gp foram comparados com o tecido tumoral correspondente e com amostras de plasma de voluntários saudáveis. Pela primeira vez, foram detectados níveis de expressão de cfRNA da P-gp em pacientes com GB, enquanto os voluntários saudáveis não apresentaram níveis de P-gp circulante detectáveis em nossos experimentos. Em conjunto, os resultados indicam que ABCB1/P-gp pode ter um impacto significativo na biologia tumoral do GB, além de sua função estabelecida de MDR. Futuramente, a detecção de P-gp circulante no sangue poderia integrar uma assinatura molecular mais ampla para o diagnóstico do GB.(AU)

The phenomenon known as multidrug resistance (MDR) observed in cancer is a major challenge in the search for more efficient therapies. This phenotype is the result of a combination of various factors, such as the high expression of efflux pumps from the ABC transporter superfamily of proteins, which prevent the accumulation of chemotherapeutic agents within tumor cells. The expression of ABC proteins such as P-gp, encoded by the Abcb1 gene, is often associated with a poor prognosis in various tumors, including glioblastoma (GB). Thus, this project aims to investigate the functions of this transporter (in addition to its known involvement in MDR) in GB malignancy by evaluating its involvement in survival, migration, and apoptosis regulation capacities, as well as its potential as a biomarker in GB via liquid biopsy. For this purpose, P-gp expression was reduced via siRNA, and the presence of P-gp cfRNA was evaluated in the plasma of GB patients. The results demonstrated, after testing in different cell lines, that P-gp expression was successfully temporarily diminished through siRNA so that its function in migration, proliferation, and regulation of programmed cell death could be evaluated through functional assays such as scratch, MTT, and caspase activity assays. A significant decrease in cell viability was observed after P-gp silencing, along with a possible relationship of Pgp with increased apoptosis, as its silencing significantly increased the apoptotic population induced by serum deprivation measured using the Caspase-Glo® 3/7 kit. On the other hand, the scratch assay results did not show significant changes in GB migratory patterns. Regarding liquid biopsy, RNA was extracted from the plasma of patients diagnosed with GB, and P-gp levels were compared with corresponding tumor tissue and plasma samples from healthy volunteers. For the first time, levels of cfRNA expression of P-gp were detected in GB patients, while healthy volunteers did not show detectable levels of circulating P-gp in our experiments. Together, the results indicate that ABCB1/P-gp may have a significant impact on GB tumor biology, in addition to its established function in MDR. In the future, the detection of circulating P-gp in blood could integrate a broader molecular signature for GB diagnosis.(AU)