Há mais de uma década que os inibidores vegetais de proteases, principalmente aqueles envolvidos no processo de coagulaçao sangüínea, vêm sendo estudados em nosso grupo. Ao longo desses anos, vários inibidores extraídos de sementes do gênero Bauhinia foram purificados e seqüenciados. Esses inibidores apresentam alta homologia e algumas diferenças na inibiçao de serinoproteases. O inibidor de tripsina isolado das sementes de Bauhinia variegata (BvTI) apresenta alta homologia com o inibidor de Fator Xa isolado das sementes de Bauhinia ungulata (BuXI). No entanto, o Bvrl nao apresenta inibiçao sobre o Fator Xa. A comparaçao das estruturas primárias do BvTI e BuXI indica que há diferença em alguns resíduos de aminoácidos na regiao do sítio reativo (Oliva et ai., 1996). O emprego de técnicas de química de proteínas nos forneceram dados substanciais a respeito da especificidade dessas proteínas para que entao pudéssemos dar um novo enfoque ao estudo desses inibidores utilizando técnicas de biologia molecular e assim, pudéssemos tentar esclarecer a especificidade desses inibidores da família Kunitz para diferentes serinoproteases.

Para tanto resolvemos:

' - Clonar e expressar o gene de um BvTI, inibidor de tripsina isolado das sementes de Bauhinia variegata, e a regiao do sítio reativo do BvTI, RS-BvTI, ativos na superfície de fago filamentoso, empregando o Sistema Phage Display; - Estabelecer um sistema de expressao para o BvTI em E. coli, utilizando o vetor pET-14b; Por fim, caracterizar as proteínas recombinantes. Para a clonagem molecular do BvTI, primeiramente foi realizada a extraçao do RNA total das sementes prematuras de B. variegata, que foi empregado como molde para a síntese do cDNA fita dupla, empregando-se técnicas de RT-PCR e PCR. O cDNA fita dupla foi clonado ao fagomídeo pCANTAB 5E e utilizado para a transformaçao de bactérias TG1. O clone pAS 1.1.3 teve a seqüência de seu inserto determinada pelo sequenciamento de nucleotídeos, o qual revelou um cDNA de 733 pb, incluindo o gene codificador de um BvTI (175 aa). A comparaçao da seqüência de aminoácidos deduzida do BvTI clonado com outros inibidores isolados de Bauhinia revelou a autenticidade do gene clonado...(au)