Caracterização das adenilato ciclases em Trypanosoma cruzi e avaliação dos seus papéis na metaciclogênese
Publication year: 2004
Theses and dissertations in Portugués presented to the Instituto Oswaldo Cruz to obtain the academic title of Doutor. Leader: Salmon, Didier
Neste trabalho procuramos caracterizar uma subfamília de adenilato ciclase associada a uma unidade poligênica localizada na região flanqueadora 3 de um novo locus THT ( o terceiro cluster de genes que codificam para a isoforma de transportador de glicose TcrHT1 ). Assim, o estudo do perfil de expressão dos genes por técnica de Northern blot revelou a presença de precursores policistrônicos, aparecendo durante a diferenciação do Trypanosoma cruzi. Este RNA sofre processamento pós-transcricional dando origem aos mRNAs menores que surgem em maior intensidade nas formas tripomastigotas metacíclicas, sugerindo que existem controles a nível pós-transcricional que podem estar ligados, diretamente ou indiretamente, ao processo de metaciclogênese. Utilizando fragmentos de DNA clonados, que codificavam para porções dos domínios amino-terminal ou C-terminal ( domínio catalítico ) produzimos e purificamos as proteínas recombinantes. Estas foram utilizadas para a produção de anticorpos específicos. O antisoro anti-domínio extracelular revelou além do fragmento esperado de 140 kDa, uma grande banda inesperada de massa molecular de cerca de 200 kDa que poderia corresponder a um precursor que sofrerá processamento pós-traducional. Durante os ensaios de western-blot ( uni e bidimensional ) ficou evidenciado que as formas tripomastigotas metacíclicas possuem uma expressão deste gene cerca de três vezes maior que nas formas epimastigotas. A análise em gel de poliacrilamida em duas dimensões, quando associada a western-blot, demonstrou a presença de pelo menos oito isoformas diferentes de adenilato ciclase, com pontos isoelétricos entre 4,5 a 5,5. Através de ensaios de imunofluorescência utilizando ambos anticorpos especificos, as marcações observadas sugerem sua localização na membrana, independente do estágio do ciclo celular do parasita. Análise por Southern-blotting propõe que as adenilato ciclases de T. cruzi estão representadas no genoma do parasita em várias cópias, sete pelo menos, não organizadas em tandem. Quando comparamos nossos resultados com dados de outros autores, fica claro o polimorfismo entre as diferentes adenilato ciclases caracterizadas.