Triagem de mutação no éxon 3 do gene IRF6 em indivíduos com fissura labiopalatina e agenesia dentária: padronização de protocolo para seqüenciamento de DNA genômico a partir de saliva
Publication year: 2009
Theses and dissertations in Portugués presented to the Universidade de São Paulo. Faculdade de Odontologia de Bauru to obtain the academic title of Doutor. Leader:
A fissura labiopalatina e a agenesia dentária são consideradas alterações do desenvolvimento embrionário. Esses fenótipos ocorrem em decorrência da interação de fatores genéticos e ambientais, caracterizando um padrão de herança multifatorial. Entre os genes candidatos a esses fenótipos destaca-se o IRF6. Para esses estudos genéticos podem ser usadas diferentes metodologias, dentre elas o seqüenciamento direto. A proposta deste estudo foi primeiramente padronizar um protocolo para seqüenciamento direto de DNA genômico a partir de saliva e então investigar mutações ou polimorfismos no éxon 3 do gene IRF6 em indivíduos com fissura de lábio e palato unilateral não-sindrômica e agenesia dentária.
Fizeram parte do estudo 120 voluntários distribuídos em quatro grupos:
Grupo 1 30 indivíduos com fissura e agenesia dentária; Grupo 2 - 30 indivíduos somente com fissura; Grupo 3 - 30 indivíduos somente com agenesia dentária e Grupo 4 - Controle. Para análise do éxon 3 do gene IRF6 foi coletada saliva, e a partir desse material foram testados três protocolos para extração de DNA genômico. Além disso, durante a padronização do protocolo para seqüenciamento direto foram avaliadas metodologias diferentes para outras três etapas da preparação das amostras: purificação do produto de PCR, otimização na utilização do BigDye® v3.1 Terminator na reação de seqüenciamento e purificação do produto da reação de seqüenciamento. As amostras foram seqüenciadas em Analisador Genético ABI 3130XL e os resultados analisados por meio de programas de computador específicos. Foram pesquisadas, nos eletroferogramas referentes ao éxon 3 do gene IRF6, variações nas seqüências de cada indivíduo. Os resultados mostraram que o protocolo de extração de DNA a partir de saliva utilizando InstaGeneTM Matrix associado à proteinase K e dodecil sulfato de sódio 1% foi o que apresentou melhores resultados na quantidade e qualidade do DNA extraído. Em relação à purificação do produto de PCR, o método de...
Cleft lip and palate and tooth agenesis are considered changes in embryonic development. These phenotypes occur as a result of the interaction of genetic and environmental factors, suggesting a multifactorial inheritance pattern. Among the candidate genes for these phenotypes IRF6 appears as one of the most important. Direct sequencing, among other techniques, can be used to perform such genetic studies. The aim of this study was to standardize a protocol for direct sequencing of genomic DNA extracted from whole saliva to allow further search of mutations or polymorphisms in exon 3 of IRF6 gene in individuals with nonsyndromic cleft lip and palate and tooth agenesis.