Clonagem e análise da expressão de genes de proteínas de mamão papaia com atividade inibitória sobre poligalacturonases fúngicas

Broetto, Sabrina Garcia

As proteínas inibidoras de poligalacturonases (PGIPs) presentes na parede celular são capazes de limitar o potencial destrutivo da poligalacturonase (PG) fúngica e, assim, constituem um tipo importante dentre os diversos sistemas de defesa do tecido vegetal frente à infecção fúngica. No mamão, o ataque fitopatogênico é o principal causador de danos pós-colheita, e sua alta susceptibilidade pode estar relacionada com a baixa eficácia ou pouca abundância dos meios de defesa anti-fitopatogênica. Uma vez que isso pode estar relacionado com as PGIPs e nada se conhece sobre o papel dessas proteínas nesse fruto, o objetivo do trabalho foi clonar os genes das PGIPs de mamoeiro e definir seu padrão de expressão em diferentes órgãos e tecidos e ao longo do amadurecimento. Para tanto, foram identificadas no genoma do mamoeiro, a partir de critérios que definem a identidade de uma PGIP, duas prováveis sequências dentre 13 candidatas iniciais. Ambas foram clonadas a partir das sequências genômicas e de cDNA, sequenciadas e sua identidade confirmada, sendo denominadas Cppgip4 e Cppgip6. As análises de expressão relativa em diversos tecidos e idades fisiológicas do mamoeiro demonstraram que os dois genes apresentaram diminuição da expressão com o desenvolvimento dos frutos, sendo que com a polpa apresentou redução dos níveis de expressão relativa de Cppgip4 em até 18 vezes dos 30 dias pós-antese (DPA) ao 9 dias pós-colheita (DPC). Na casca também houve redução significativa da expressão com o desenvolvimento. Para a expressão absoluta, nos frutos, sementes, caules, raízes e folhas, o número de cópias de ambos os transcritos decresceu com o desenvolvimento, sendo cerca de cem mil vezes mais abundante para Cppgip6 que para Cppgip4. As tentativas de expressão de proteínas recombinantes em Pichia pastoris não geraram resultado positivo, provavelmente em virtude das condições ideais de indução ainda não terem sido estabelecidas corretamente para o ensaio. A atividade de PGIPs extraídas diretamente do tecido foi medida por análise de difusão em ágar empregando pectinase de Aspergillus niger e revelou uma tendência à diminuição da porcentagem de inibição à medida que os frutos se desenvolveram, em concordância com os resultados da análise por qPCR. O conjunto de resultados sugere que a expressão varia com o estádio de desenvolvimento do fruto e é tecido-específica, possivelmente em resposta à diferente susceptibilidade dos tecidos ao ataque fitopatogênico, indicando que menores níveis de transcritos e atividade no amadurecimento, período de maior susceptibilidade, poderiam sinalizar para a regulação do processo degradativo marcando o início da senescência

Polygalacturonase inhibiting proteins (PGIPs) present in plant cell walls are able to inhibit the destructive action of fungal polygalacturonase (PG). In this way, they constitute an important type of plant defense system against fungal infections. In papaya fruit, the pathogenic attack is the main cause of post harvesting loss, and its high susceptibility may be related to the low efficiency or low abundance of anti-phytopathogenic defense. Since this fact could be related to PGIPs expression and little is known about the response of these proteins in the fruit, the aim of the present work was to clone the genes of PGIPs papaya fruit and set their expression pattern in different organs and tissues throughout fruit ripening. Thus, two probable PGIP sequences among 13 initial candidates were identified in the papaya genome by using specific criteria. Both sequences were cloned from cDNA and genomic samples, sequenced and confirmed its identity, and then being named Cppgip4 and Cppgip6. Analysis of relative expression in various tissues at different physiological stages demonstrated that both genes were down regulated during fruit development. The relative expression levels of Cppgip4 in papaya pulp was reduced by 18 times from the 30 days post-anthesis (DPA) to the 9 days post-harvest (DPH). Similarly, gene expression in papaya peel was significant down regulated during fruit development. Absolute expression analysis revealed gene expressions in the fruit pulp, seed, stem, root and leaf were also down regulated within development. Moreover, Cppgip6 gene expression was a hundred thousand times more abundant than Cppgip4. The recombinant protein expression in Pichia pastoris did not result positive, probably because of the ideal conditions of induction have not been properly established the yet. The activity of PGIPs extracted directly from the tissue was measured by the agar diffusion assay using pectinase from Aspergillus niger and showed decrease of inhibition during fruit developed in accordance with the results of the qPCR analysis. Based on the results it is possible to suggest the expression of these genes varies temporally with the developmental stage of the fruit and is tissue-specific, possibly in response to the different susceptibility of tissues to pathogenic attack. In addition, the lowest levels of PGIP expression were achieved at the fruit ripening, when the susceptibility to fungal infection is high and could signal for regulating the degradation process characterized by the onset of senescence