Participação do nicho endosteal na regulação da hemopoese de camundongos submetidos à desnutrição proteica

Tsujita, Maristela

O nicho endosteal da medula óssea abriga as células-tronco hemopoéticas (CTH) em quiescência/autorrenovação.

As CTH podem ser classificadas em dois grupos:

células que reconstituem a hemopoese em longo prazo (LT-CTH) e curto prazo (CT-CTH). Investigamos, neste trabalho, os efeitos da desnutrição proteica (DP) no tecido ósseo e a participação do nicho endosteal na sinalização osteoblasto-CTH. Para tanto, utilizamos camundongos submetidos à DP induzida pelo consumo de ração hipoproteica. Os animais desnutridos apresentaram pancitopenia e diminuição nas concentrações de proteínas séricas e albumina. Quantificamos as CTH por citometria de fluxo e verificamos que os desnutridos apresentaram menor porcentagem de LT-CTH, CT-CTH e de progenitores multipotentes (PMP). Avaliamos a expressão das proteínas CD44, CXCR4, Tie-2 e Notch-1 nas LT-CTH. Observamos diminuição da expressão da proteína CD44 nos desnutridos. Isolamos as células LT-CTH por cell sorting e avaliamos a expressão gênica de CD44, CXCR4 e NOTCH-1. Verificamos que os desnutridos apresentaram menor expressão de CD44. Em relação ao ciclo celular, verificamos maior quantidade de LT-CTH nas fases G0/G1. Caracterizamos as alterações do tecido ósseo femoral, in vivo. Observamos diminuição da densidade mineral óssea e da densidade medular nos desnutridos. A desnutrição acarretou diminuição da área média das seções transversais, do perímetro do periósteo e do endósteo na cortical do fêmur dos animais. E na região trabecular, verificou-se diminuição da razão entre volume ósseo e volume da amostra e do número de trabéculas, aumento da distância entre as trabéculas e prevalência de trabéculas ósseas em formato cilíndrico. Avaliamos a expressão de colágeno, osteonectina (ON) e osteocalcina (OC) por imuno-histoquímica, e de osteopontina (OPN) por imunofluorescência no fêmur e verificamos diminuição da marcação para OPN, colágeno tipo I, OC e ON nos desnutridos. Evidenciamos, pela técnica do Picrosírius, desorganização na distribuição das fibras colágenas e presença de fibras tipo III nos fêmures dos desnutridos, além de maior número de osteoclastos evidenciados pela reação da fosfatase ácida tartarato resistente. Os osteoblastos da região femoral foram isolados por depleção imunomagnética, imunofenotipados por citometria de fluxo e cultivados em meio de indução osteogênica. Observamos menor positividade para fosfatase alcalina e vermelho de alizarina nas culturas dos osteoblastos dos desnutridos. Avaliamos, por Western Blotting, a expressão de colágeno tipo I, OPN, osterix, Runx2, RANKL e osteoprotegerina (OPG), e, por PCR em tempo real, a expressão de COL1A2, SP7, CXCL12, ANGPT1, SPP1, JAG2 e CDH2 nos osteoblastos isolados. Verificamos que a desnutrição acarretou diminuição da expressão proteica de osterix e OPG e menor expressão gênica de ANGPT1. Avaliamos a proliferação das células LSK (Lin-Sca1+c-Kit+) utilizando ensaio de CFSE (carboxifluoresceína succinimidil ester). Foi realizada cocultura de células LSK e osteoblastos (MC3T3-E1) na presença e ausência de anti-CD44. Após uma semana, verificamos menor proliferação das LSK dos desnutridos. O bloqueio de CD44 das LSK do grupo controle diminuiu a proliferação destas em três gerações. Entretanto, nos desnutridos, esse bloqueio não afetou a proliferação. Concluímos que a DP promoveu alterações no tecido ósseo e nas CTH. Entretanto, não podemos afirmar que as alterações observadas no sistema hemopoético foram decorrentes de alterações exclusivas do nicho endosteal

The bone marrow endosteal niche hosts hematopoietic stem cells (HSC) in quiescence/self-renewal.

HSC can be classified into two groups:

cells capable of renewing indefinitely (LT-HSC) or repopulating in the short term (ST-HSC). In this work, we investigated the effects of protein malnutrition (PM) on bone tissue and the involvement of the endosteal niche in osteoblast-CTH signaling. Therefore, we used mice subjected to PM induced by the consumption of hypoproteic feed. Malnourished animals presented pancytopenia and decreased concentration of serum protein and albumin. We quantified the HSC by flow cytometry and found that the malnourished ones had lower percentage of LT-HSC, ST-HSC and multipotent progenitors (MPP). We assessed the expression of the CD44, CXCR4, Tie-2 and Notch-1 proteins in LT-HSC. We observed decreased expression of CD44 protein with the malnourished ones. We isolated the LT-HSC cells by means of cell sorting and assessed the gene expression of CD44, CXCR4 and NOTCH-1. We found that malnutrition had lower expression of CD44. Regarding the cell cycle, we see greater amount of LT-HSC in the G0 and G1 phases. We characterized the changes of the femoral bone tissue in vivo. We observed a decrease in the bone mineral density and medullar density in malnourished animals. As for malnourished animals, the femoral cortical region showed a significant decrease in tissue area, periosteal and endosteal perimeter. The femoral trabecular region of malnourished animals showed decreased bone volume/tissue volume ratio, decreased trabecular number, increased trabecular separation and prevalence of rod-like trabeculae. We investigated the expression of collagen, osteonectin (ON) and osteocalcin (OC) by means of immunohistochemistry and the expression of osteopontin (OPN) by immunofluorescence and we found that malnourished animals showed decreased labeling for OPN, type I collagen, OC and ON in the cortical region of the femur. Picrosirius staining was used to analyze disorganization of collagen fibers and presence of type III fibers in the femurs of the malnourished. Cortical and trabecular regions of malnourished animals presented a higher number of osteoclasts as shown by tartrate-resistant acid phosphatase reaction. Moreover, osteoblasts were isolated from the femoral region by immunomagnetic depletion and immunophenotyped by flow cytometry and cultured in osteogenic induction medium. Results proved less positive for alkaline phosphatase and alizarin red in the cultures of osteoblasts of malnourished animals. We assessed, by means of Western blotting, type I collagen expression, OPN, osterix, Runx2, RANKL and osteoprotegerin (OPG) and, by real time PCR, the expression of COL1A2, SP7, CXCL12, ANGPT1, SPP1, JAG2 and CDH2 with the isolated osteoblasts. We found that malnutrition led to osterix and OPG decreased protein expression and lower ANGPT1 gene expression. We evaluated LSK cell (Lin-Sca1+c-Kit+) proliferation by CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester). LSK cells and osteoblasts (MC3T3-E1) cocultures were performed in the presence and absence of anti-CD44. After a week, we found lower proliferation of LSK in the malnourished. The LSK CD44 blocking in the control group decreased the proliferation of these three generations. However, as for the malnourished, such blockage did not affect proliferation. We concluded that the PM has promoted changes in bone tissue and the CTH. However, we can't claim that the alterations observed in hematopoietic system were due to endosteal niche-only changes