O presente estudo avaliou, ex vivo, atividade antimicrobiana do ozônio, associado ao veículo propilenoglicol e ao hidróxido de cálcio em canais radiculares contaminados com Enterococcus faecalis. Foram utilizados 50 dentes humanos unirradiculados, doados pelo Banco de Dentes da Faculdade de Odontologia de Araraquara. Após remoção das coroas dentárias, os canais radiculares foram instrumentados até uma lima endodôntica tipo kerr de número 50, e em seguida, os espécimes foram esterilizados, e os canais radiculares contaminados com E. faecalis e incubados a 37 ± 1°C por 21 dias. Os espécimes foram aleatoriamente divididos em cinco grupos experimentais, de acordo com a medicação utilizada: GI – Ozônio com propilenoglicol (n=11); GII - hidróxido de cálcio com paramonoclorofenolcanforado - PMCC (n=11), GIII – propilenoglicol com pó de hidróxido de cálcio ozonizado (n=11), GIV – grupo controle positivo – não foi colocada nenhuma medicação (n=11) e GV – grupo controle negativo – não foram contaminados (n=6). As coletas foram realizadas coletas após sete e quatorze dias e o crescimento microbiano verificado por meio da contagem de unidades formadoras de colônia (UFC) de E. faecalis. Os resultados que foram submetidos ao teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn e também pelo teste nãoparamétrico de Friedman sendo ambos com um nível de significância de 0,05, mostraram que o propilenoglicol ozonizado e o hidróxido de cálcio com PMCC reduziram estatisticamente o número de bactérias quando comparados ao grupo controle positivo em 7 e 14 dias, não apresentando diferenças estatísticas entre eles; o hidróxido de cálcio ozonizado não reduziu estatisticamente o número de bactérias quando comparados ao grupo controle positivo em 7 e 14 dias e o propilenoglicol ozonizado e o hidróxido de cálcio PMCC não apresentaram diferença estatística entre eles em 7 e 14 dias. Em uma ordem decrescente de ação bactericida nos dois períodos analisados, encontra-se o hidróxido de cálcio PMCC, seguido do propilenoglicol ozonizado e hidróxido de cálcio ozonizado