Efeito microbiológico e citotóxico de sistemas nanoestruturados bioadesivos contendo fragmentos de peptídeos
Microbiological and citotoxicity effect of nanostructured bioadhesive system containing peptide fragments
Publication year: 2017
Theses and dissertations in Inglés presented to the Universidade Estadual Paulista "Julio de Mesquita Filho". Faculdade de Odontologia de Araçatuba to obtain the academic title of Doutor. Leader: Cunha, Robson Frederico
O uso de agentes antimicrobianos naturais que reduzam a adesão e proliferação de S. mutans no biofilme poderia ser uma estratégia interessante para o controle da cárie dentária. No entanto, a estabilidade química e física de alguns desses agentes, como os peptídeos catiônicos antimicrobianos e fragmentos de peptídeos, pode ser comprometida por fatores externos, como temperatura e pH, reduzindo sua ação antimicrobiana. Com isso, os objetivos deste estudo foram desenvolver e caracterizar sistemas de liberação de fármaco nanoestruturados bioadesivos para a incorporação dos fragmentos peptídicos D1-23 e P1025 e avaliar seu efeito citotóxico e atividade contra biofilme de S. mutans. A primeira formulação (F1), composta de ácido oleico, polyoxypropylene-(5)-polyoxyethylene-(20)-cetyl alcohol (PPCA), Carbopol® 974P e Carbopol® 971P, foi analisada por microscopia de luz polarizada (MLP), reologia e bioadesão in vitro. A concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) de D1-23 foram determinadas contra S. mutans para posterior avaliação da atividade sobre biofilme formado após 4h e 24h de tratamento. A segunda formulação (F2) foi selecionada a partir de três diferentes concentrações de ácido oleico, PPCA e Carbopol® 974P. Cada formulação foi analisada por MLP, espalhamento de raios x a baixo ângulo (SAXS), reologia e bioadesão. CIM e CBM de P1025 sobre S. mutans e seu efeito quando incorporado ou não em F2 sobre biofilme de S. mutans em formação foram analisados. A citotoxicidade em células epiteliais HaCat foi avaliada para os dois sistemas líquido cristalino (SLC) usando testes de MTT. Análise descritiva foi realizada para os dados dos ensaios de caracterização e para os ensaios microbiológicos e citotóxicos os dados foram submetidos aos testes de ANOVA/Tukey ou Kruskall-Wallis/Mann-Whitney U (p<0.05). Os resultados indicaram que F1 apresentou características de SLC com alta viscosidade e bioadesão. CIM e CBM de D1-23 foram de 15,60 e 31,25µg/mL, respectivamente. D1-23 incorporado em F1 apresentou melhores resultados contra biofilme de S. mutans que quando em solução, após 24h de tratamento. F2 apresentou melhores propriedades reológicas e força bioadesiva comparada aos demais sistemas, caracterizando um SLC. P1025 teve somente efeito inibitório sobre S. mutans (CIM=0.25 mg/mL). O efeito antibiofilme de P1025 incorporado em F2 foi observado após 24h de tratamento, principalmente quando aplicado na fase de adesão. Ambos os SLC contendo D1-23 e P1025 não apresentaram toxicidade sobre as células epiteliais, nas condições de tempo e concentrações avaliadas. A incorporação de peptídeos em SLC bioadesivos nanoestruturados aumenta suas propriedades antimicrobianas, podendo ser uma interessante estratégia para a prevenção da cárie dentária(AU)
The use of natural antimicrobial agents for reducing the adhesion and proliferation of S. mutans in the biofilm could be an interesting strategy for the control of dental caries. However, the chemical and physical stability of some natural antimicrobials, such as cationic antimicrobial peptides and peptide fragments, can be compromised by external factors such as temperature and pH, reducing their antimicrobial action. Thus, the objectives of this study were to develop and characterize nanostructured bioadhesive drug delivery systems for the incorporation of D1-23 and P1025 peptide fragments and to evaluate their citotoxicy and activity against S. mutans biofilm. The first formulation (F1) was composed of oleic acid, polyoxypropylene- (5) -polyoxyethylene- (20) - cetyl alcohol (PPCA), Carbopol® 974P and Carbopol® 971P and analyzed by polarized light microscopy (PLM), rheology and in vitro bioadhesion. Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimal bacterial concentration (MBC) of D1-23 were determined against S. mutans for further evaluation of activity against S. mutans biofilm after 4h and 24h of treatment. The second formulation was selected from three different concentrations of oleic acid, PPCA and Carbopol® 974P. Each formulation was analyzed by PLM, small-angle x-ray scattering (SAXS), rheology and bioadhesion. MIC and MBC of P1025 were determined against S. mutans. Thus, P1025 was incorporated in the best formulation (F2). The effect of P1025 incorporated or not into F2 on S. mutans biofilm formation was analyzed. Cytotoxicity in HaCat epithelial cells for both formulations was evaluated using MTT assays. Descriptive analysis was performed for the characterization assays and data from microbiological and cytotoxic assays were submitted to ANOVA / Tukey or Kruskall-Wallis / Mann-Whitney U (p<0.05). The results indicated that F1 presented characteristics of liquid-crystalline type system (LCS) with high viscosity and bioadhesion. The MIC and MBC of D1-23 were 15.60 and 31.25μg / mL, respectively. D1-23 incorporated in F1 showed better results than D1-23 in solution against S. mutans biofilm after 24h. F2 had better rheological properties and bioadhesive strength compared to other systems analyzed and characteristics of LCS. P1025 had only inhibitory effect against S. mutans (MIC=0.25mg/mL). The antibiofilm effect of P1025 incorporated into F2 was observed after 24h of treatment, mainly when applied in surface-bound salivary phase. Both LCS had no toxicity on epithelial cells, considering time and concentrations tested. The incorporation of peptides in nanostructured bioadhesive LCS increased their antimicrobial properties and could be an interesting strategy for caries prevention(AU)