Ultrassequenciamento exômico dos principais genes relacionados com a hipercolesterolemia familial
Ultrasequensing exomic of the main genes related to familial hypercholesterolemia
Publication year: 2019
Theses and dissertations in Portugués presented to the Universidade de São Paulo. Faculdade de Ciências Farmacêuticas to obtain the academic title of Doutor. Leader: Hirata, Mario Hiroyuki
A frequência de Hipercolesterolemia Familial (HF) ainda é desconhecida no Brasil, principalmente pela ausência de estudos com caracterização genotípica associada à fenotípica. Os dados epidemiológicos existentes se baseiam apenas no fenótipos e carecem do diagnóstico molecular confirmatório. O objetivo do presente estudo foi identificar as principais causas genéticas da HF em pacientes diagnosticados fenotipicamente através de um painel exômico com 61 genes a fim de contribuir para um sistema de confirmação do diagnostico molecular em uma amostra da população brasileira. Para isso foram incluídos 141 pacientes, não aparentados, portadores de HF atendidos pelo setor de dislipidemias do Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia, Laboratório de Analises Clinicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte e do Programa Hipercol Brasil do Instituto do Coração. As amostras de sangue periférico foram obtidas para determinações fenotípicas laboratoriais e extração de DNA genômico. A biblioteca de DNA foi construída utilizando o kit Nextera® Rapid Capture Enrichment Custom enriquecendo os éxons de 61 genes que direta ou indiretamente estão relacionados com metabolismo do colesterol. O ultrassequenciamento foi realizado utilizando kit MiSeq Reagent (300 a 500 ciclos) na plataforma MiSeq (Illumina). Os resultados de sequenciamento foram inicialmente alinhados a uma sequência referência e analisados para eliminação de falsos positivos, segundo os parâmetros de qualidade, tais como: cobertura mínima de 30x, frequência do alelo alterado maior que 20% e diferença da distribuição das leituras entre as sequências nucleotídicas menor que 15%. Foram identificadas 472 diferentes variantes em 56 dos genes presentes no painel, sendo 45 consideradas como não descritas. Nos genes APOA1, APOA2, LIPC, RBP4 e TIMP1 não foram observadas variantes dentro dos critérios estabelecidos. Das variantes observadas 25 identificadas em 30 (21,2%) pacientes já tinha sido publicadas em relação à HF nos três principais genes (LDLR, APOB e PCSK9), confirmando o diagnóstico. Foi caracterizado genotipicamente outras dislipidemias primárias em 7 pacientes, sem diagnóstico molecular de HF, através de variantes identificadas no ultrassequenciamento em outros genes. Dos 104 pacientes que não possuíam nenhuma variante já previamente caracterizada, 69 possuíam variantes relacionados com o metabolismo do colesterol. As variantes sem patogenicidade conhecida foram avaliadas através de ferramentas de predição in silico e 22 delas possuíam características sugestivas de patogenicidade em pelo menos 4 das ferramentas utilizadas, duas delas também mostraram alterar a estrutura da proteína segundo análises de docking molecular. Foram identificadas também 223 variantes em região não transcritas (UTR). Quando realizada as análises estatística de todas as variantes identificadas, observamos associação de 13 variantes com concentrações mais elevadas de colesterol da LDL, 5 com concentrações mais elevadas de apolipoproteina B-100, 5 com concentrações mais elevadas de colesterol total, 6 com presença de arco córneo, 2 com manifestação de xantelasmas, 2 com ausência de xantomas e 3 com a presença de doença arterial coronariana. Dessas 6 variantes já haviam sido previamente descritas com HF ou algum outro fenótipo associado e 2 não tinham citação na literatura pesquisada, mas possuíam característica patogênica para a proteína segundo as ferramentas de predição in silico. Este estudo permitiu a identificação das causas genéticas da HF em pacientes brasileiros diagnosticados fenotipicamente, mostrando que a técnica escolhida permitiu caracterizar 21,2% dos pacientes. Além disso, foi possível identificar outras dislipidemias primárias e caracterizar algumas variantes que, apesar de necessitarem serem validadas, indicam uma possível associação com a HF, aumentando o esclarecimento do fenótipo com o genótipo para 74,5%. Este estudo também possibilitou a identificação de novas variantes que devem ser avaliadas para confirmar associação com a doença e utilizar para o diagnóstico propondo um novo painel poligênico
The frequency of Familial Hypercholesterolemia (FH) is still unknown in Brazil, mainly due to the absence of studies with genotypic characterization associated with phenotype. Existing epidemiological data are based only on the phenotypes and lack the confirmatory molecular diagnosis. The aim of the present study was to identify main genetic causes of FH in patients diagnosed phenotypically through an exomic panel with 61 genes in order to contribute to a system of confirmation molecular diagnosis in a sample of the Brazilian population. To this end, 141 non-related patients with FH treated by the dyslipidemia sector of the Institute Dante Pazzanese of Cardiology, Clinical Analysis Laboratory of the Faculty of Pharmaceutical Sciences of the University Federal of Rio Grande do Norte and the Hipercol Brazil Program of the Heart Institute. Peripheral blood samples were obtained for laboratory phenotypic determinations and extraction of genomic DNA. The DNA library was constructed using the Nextera® Rapid Capture Enrichment Custom kit, enriching with éxons of 61 genes that are directly or indirectly related to cholesterol metabolism. Ultrasequencing was performed using MiSeq Reagent kit (300 to 500 cycles) on the MiSeq platform (Illumina).