Métodos de preservación de espermatozoides mediante la refrigeración o el congelamiento han sido desarrollados para espermatozoides caninos; sin embargo, la tasa de fecundación artificial es baja, posiblemente por daños celulares aún no determinados. El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la refrigeración sobre la motilidad, actividad mitocondrial, integridad de membrana acrosomal y reacción acrosomal en espermatozoides caninos incubados en tres medios distintos (Ferp Talp, CCMm, Sp Talp), utilizando nuevas metodologías (Mito Tracker, Lyso Tracker, SBTI). Los resultados indicaron una disminución significativa (p menor que 0.05) en la motilidad, viabilidad e integridad del acrosoma en espermatozoides refrigerados en comparación con los frescos; así como una dinámica de reacción diferente en espermatozoides refrigerados respecto a los frescos. Por otra parte, los medios Sp Talp y CCMm dieron mejores resultados en mantenimiento de la motilidad, actividad mitocondrial e integridad de membrana acrosomal.