Avalicao da infeccao filarial por Wuchereria bancrofti antes do inicio do tratamento massivo para eliminacao da filariase linfatica no Distrito de Murrupula, Provincia Nampula-Mocambique
Ano de publicação: 2015
Teses e dissertações em Português apresentado à Instituto Oswaldo Cruz para obtenção do título de Mestre. Orientador: Brandão, Adeilton Alves
A Wuchereria bancrofti é responsável por mais de 90% dos casos da Filaríase Linfática no
mundo todo. Em Moçambique, 103 distritos são endémicos para a doença com as prevalências
mais altas na região norte do país. A eliminação da doença esta prevista para o ano 2020 e pode
ser alcançada pelo tratamento massivo das populações das áreas endémicas durante 5-6 anos com
ivermectina e albendazole. A avaliação do impacto do tratamento e a verificação da eliminação
da doença carece de ferramentas de diagnóstico com sensibilidade suficiente para detectar os
mais pequenos vestígios de infecção remanescente. Entre elas, o teste imunocromatográfico
(ICT) para pesquisa do antígeno filarial circulante (AFC), a gota espessa (GE) de sangue para
pesquisa de microfilárias (Mf) e a PCR para a detecção têm sido frequentemente utilizadas antes
(baseline), durante e após a campanha de eliminação com vista a monitorar a situação de
transmissão da doença. Assim, no presente inquérito de base (baseline) propusemo-nos a avaliar a
presença da infecção filarial por Wuchereria bancrofti antes do início do tratamento massivo
pelos métodos comummente utilizados (teste imunocromatográfico e gota espessa) e também
faze-lo utilizando um método de detecção molecular (PCR) para o efeito de padronização da
técnica. As amostras de sangue foram colhidas no período nocturno entre as 21h-2h da manhã por
punção digital. O teste imunocromatográfico foi realizado durante o inquérito utilizando 100 µL
de sangue. As lâminas foram coradas pelo Giemsa e duplamentes observadas ao microscópio
óptico para contagem de microfilárias. O ADN foi extraído a partir de pequenas quantidades de
sangue seco em papel de filtro utilizando o Kit comercial Dneasy® Blood & Tissue da
QUIAGEN. A PCR foi realizada para amplificar um seguimento de 188 pb da região repetitiva
do genoma de W. Bancrofti (SspI ) e, também para amplificar o gene mitocondrial Citocromo
oxidase 1 (Cox1). Os produtos da PCR foram analisados por electroforese em gel de agarose (1,5
%) e tampão tris-borato-EDTA (TBE), e os fragmentos de ADN visualizados sob iluminação
UV. Foram incluídos 678 indivíduos com idade média de 20,7 (SD= 16.71) anos. O AFC esteve
presente em 26 % (176/678) dos indivíduos. A prevalência dos portadores de microfilária foi
12,4% (84/678) e a densidade microfilárial foi de 244,12 Mf Mf/mL. Cerca de 6,8% (46/678) dos
inqueridos tinham algum tipo de sintoma relacionado a doença. A PCR para amplificação da
região repetitiva SspI detectou 15,5 % (105/678) de casos de infecção, enquanto que a PCR para
amplificação Cox1 detectou apenas 7,1% (48/678) que foram conduzidos ao sequenciamento.
Foram analizadas 14 sequências e identificadas três mutaçoes em 12 delas. A pesquisa do AFC
pelo ICT continua sendo o mais sensível indicador da infecção filarial por W. bancrofti enquanto
que a PCR pode ser utilizada para determinar a microfilarêmia de forma eficiente e com mais
sensibilidade que o método microscópico de gota espessa comumente utilizado nos programas de
avaliação do impacto da administração massiva de drogas sobre a microfilarêmia.
The Wuchereria bancrofti is responsible for more than 90% of Lymphatic Filariasis worldwide
cases. In Mozambique, 103 districts are endemic for the disease with the highest prevalence in
the northern region of the country. The elimination of the disease is expected for 2020 and can be
achieved by mass treatment of populations of the endemic areas for 5-6 years with ivermectin and
albendazole. The treatment impact evaluation and verification of the desease elimination lacks
diagnostic tools with sufficient sensitivity to detect the smallest traces of the remaining infection.
Among them, the immunochromatographic test (ICT) for circulating filarial antigen (CFA)
detention, the thick blood film(TBF) for microfilariae research (Mf) and PCR for parasite DNA
detention have been frequently used before (in baseline), during and after elimination program to
monitor the situation of the disease transmission. Therefore, in this baseline survey our purpose
was to evaluate the presence of filarial infection by Wuchereria bancrofti before the mass
treatment using the commonly diagnostic methods (immunochromatographic rapid test and thick
blood film) and also using a molecular method (PCR) for technical standardization effect. Blood
samples were collected during nocturnal period between 9 pm and 2 am by digital lancing. The
rapid immunochromatographic card test (ICT) were performed during the survey using 100 µL of
blood. The slides were stained with giemsa (10%) and double cheked for the microfilariae
counting using optic microscope. The DNA was extracted from small amount blood dried on
filter peper using Dneasy® Blood & Tissue commercial Quiagen kit. A PCR were performed to
amplify 188 bp fragment of repetitive SspI region of the W. bancrofti genome, and also to
amplify cytochrome oxidase 1 (COX1) mitochondrial gene. The PCR products were analyzed by
electrophoresis of agarose gel (1,5%) and tris-borate-EDTA buffer (TBE), and the DNA
fragments were visualized under UV illumination. We included 678 individuals whose average
age was 20.7 (SD = 16.71) years. The CFA was present in 26% (176/678) of surveyed. The
microfilaria prevalence was 12.4% (84/678) and the microfilárial density was 244.12 Mf Mf/mL.
About 6.8% (46/678) of the surveyed had symptoms related to the disease. The PCR for the SspI
aplification detected 15.5% (105/678) cases of filarial infection while the PCR for Cox1
amplification detected only 7.1% (48/678) cases which were conducted for sequencing. We
analysed 14 sequences and identified three mutations in 12 of the sequences. The filarial
circulating antigen research by ICT cards remains the most sensitive indicator of the W. bancrofti
filarial infection while the PCR can be used to determine the microfilaraemia efficiently and with
greater sensitivity than the thick blood film method wich is commonly used in the MDA impact
evaluation programme.