Avalicao da infeccao filarial por Wuchereria bancrofti antes do inicio do tratamento massivo para eliminacao da filariase linfatica no Distrito de Murrupula, Provincia Nampula-Mocambique

Ano de publicação: 2015
Teses e dissertações em Português apresentado à Instituto Oswaldo Cruz para obtenção do título de Mestre. Orientador: Brandão, Adeilton Alves

A Wuchereria bancrofti é responsável por mais de 90% dos casos da Filaríase Linfática no mundo todo. Em Moçambique, 103 distritos são endémicos para a doença com as prevalências mais altas na região norte do país. A eliminação da doença esta prevista para o ano 2020 e pode ser alcançada pelo tratamento massivo das populações das áreas endémicas durante 5-6 anos com ivermectina e albendazole. A avaliação do impacto do tratamento e a verificação da eliminação da doença carece de ferramentas de diagnóstico com sensibilidade suficiente para detectar os mais pequenos vestígios de infecção remanescente. Entre elas, o teste imunocromatográfico (ICT) para pesquisa do antígeno filarial circulante (AFC), a gota espessa (GE) de sangue para pesquisa de microfilárias (Mf) e a PCR para a detecção têm sido frequentemente utilizadas antes (baseline), durante e após a campanha de eliminação com vista a monitorar a situação de transmissão da doença. Assim, no presente inquérito de base (baseline) propusemo-nos a avaliar a presença da infecção filarial por Wuchereria bancrofti antes do início do tratamento massivo pelos métodos comummente utilizados (teste imunocromatográfico e gota espessa) e também faze-lo utilizando um método de detecção molecular (PCR) para o efeito de padronização da técnica. As amostras de sangue foram colhidas no período nocturno entre as 21h-2h da manhã por punção digital. O teste imunocromatográfico foi realizado durante o inquérito utilizando 100 µL de sangue. As lâminas foram coradas pelo Giemsa e duplamentes observadas ao microscópio óptico para contagem de microfilárias. O ADN foi extraído a partir de pequenas quantidades de sangue seco em papel de filtro utilizando o Kit comercial Dneasy® Blood & Tissue da QUIAGEN. A PCR foi realizada para amplificar um seguimento de 188 pb da região repetitiva do genoma de W. Bancrofti (SspI ) e, também para amplificar o gene mitocondrial Citocromo oxidase 1 (Cox1). Os produtos da PCR foram analisados por electroforese em gel de agarose (1,5 %) e tampão tris-borato-EDTA (TBE), e os fragmentos de ADN visualizados sob iluminação UV. Foram incluídos 678 indivíduos com idade média de 20,7 (SD= 16.71) anos. O AFC esteve presente em 26 % (176/678) dos indivíduos. A prevalência dos portadores de microfilária foi 12,4% (84/678) e a densidade microfilárial foi de 244,12 Mf Mf/mL. Cerca de 6,8% (46/678) dos inqueridos tinham algum tipo de sintoma relacionado a doença. A PCR para amplificação da região repetitiva SspI detectou 15,5 % (105/678) de casos de infecção, enquanto que a PCR para amplificação Cox1 detectou apenas 7,1% (48/678) que foram conduzidos ao sequenciamento. Foram analizadas 14 sequências e identificadas três mutaçoes em 12 delas. A pesquisa do AFC pelo ICT continua sendo o mais sensível indicador da infecção filarial por W. bancrofti enquanto que a PCR pode ser utilizada para determinar a microfilarêmia de forma eficiente e com mais sensibilidade que o método microscópico de gota espessa comumente utilizado nos programas de avaliação do impacto da administração massiva de drogas sobre a microfilarêmia.
The Wuchereria bancrofti is responsible for more than 90% of Lymphatic Filariasis worldwide cases. In Mozambique, 103 districts are endemic for the disease with the highest prevalence in the northern region of the country. The elimination of the disease is expected for 2020 and can be achieved by mass treatment of populations of the endemic areas for 5-6 years with ivermectin and albendazole. The treatment impact evaluation and verification of the desease elimination lacks diagnostic tools with sufficient sensitivity to detect the smallest traces of the remaining infection. Among them, the immunochromatographic test (ICT) for circulating filarial antigen (CFA) detention, the thick blood film(TBF) for microfilariae research (Mf) and PCR for parasite DNA detention have been frequently used before (in baseline), during and after elimination program to monitor the situation of the disease transmission. Therefore, in this baseline survey our purpose was to evaluate the presence of filarial infection by Wuchereria bancrofti before the mass treatment using the commonly diagnostic methods (immunochromatographic rapid test and thick blood film) and also using a molecular method (PCR) for technical standardization effect. Blood samples were collected during nocturnal period between 9 pm and 2 am by digital lancing. The rapid immunochromatographic card test (ICT) were performed during the survey using 100 µL of blood. The slides were stained with giemsa (10%) and double cheked for the microfilariae counting using optic microscope. The DNA was extracted from small amount blood dried on filter peper using Dneasy® Blood & Tissue commercial Quiagen kit. A PCR were performed to amplify 188 bp fragment of repetitive SspI region of the W. bancrofti genome, and also to amplify cytochrome oxidase 1 (COX1) mitochondrial gene. The PCR products were analyzed by electrophoresis of agarose gel (1,5%) and tris-borate-EDTA buffer (TBE), and the DNA fragments were visualized under UV illumination. We included 678 individuals whose average age was 20.7 (SD = 16.71) years. The CFA was present in 26% (176/678) of surveyed. The microfilaria prevalence was 12.4% (84/678) and the microfilárial density was 244.12 Mf Mf/mL. About 6.8% (46/678) of the surveyed had symptoms related to the disease. The PCR for the SspI aplification detected 15.5% (105/678) cases of filarial infection while the PCR for Cox1 amplification detected only 7.1% (48/678) cases which were conducted for sequencing. We analysed 14 sequences and identified three mutations in 12 of the sequences. The filarial circulating antigen research by ICT cards remains the most sensitive indicator of the W. bancrofti filarial infection while the PCR can be used to determine the microfilaraemia efficiently and with greater sensitivity than the thick blood film method wich is commonly used in the MDA impact evaluation programme.

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